โปรตีโอมิกส์ที่ครอบคลุมเผยให้เห็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของน้ำไขสันหลังจากสมองสำหรับโรคอัลไซเมอร์ที่ไม่มีอาการและแสดงอาการ

โรคอัลไซเมอร์ (AD) ขาดตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของโปรตีนที่สะท้อนถึงพยาธิสรีรวิทยาที่ซ่อนอยู่หลายประการ ซึ่งเป็นอุปสรรคต่อความก้าวหน้าของการวินิจฉัยและการรักษา ที่นี่เราใช้โปรตีโอมิกส์ที่ครอบคลุมเพื่อระบุตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของน้ำไขสันหลัง (CSF) ที่เป็นตัวแทนของพยาธิสรีรวิทยา AD ที่หลากหลาย มัลติเพล็กซ์แมสสเปกโตรเมตรีระบุโปรตีนประมาณ 3,500 และประมาณ 12,000 ใน AD CSF และสมองตามลำดับ การวิเคราะห์แบบเครือข่ายของโปรตีโอมในสมองได้แก้ไขโมดูลความหลากหลายทางชีวภาพ 44 โมดูล โดย 15 โมดูลในนั้นทับซ้อนกับโปรตีโอมของน้ำไขสันหลัง เครื่องหมาย CSF AD ในโมดูลที่ทับซ้อนกันเหล่านี้ถูกพับออกเป็นห้ากลุ่มโปรตีน ซึ่งแสดงถึงกระบวนการทางพยาธิสรีรวิทยาที่แตกต่างกัน ไซแนปส์และสารเมตาบอไลต์ในสมอง AD ลดลง แต่ CSF เพิ่มขึ้น ในขณะที่ไมอีลิเนชันที่อุดมไปด้วยเกลียและกลุ่มภูมิคุ้มกันในสมองและ CSF เพิ่มขึ้น ความสม่ำเสมอและความจำเพาะของโรคของการเปลี่ยนแปลงแผงได้รับการยืนยันในตัวอย่าง CSF เพิ่มเติมมากกว่า 500 ตัวอย่าง กลุ่มเหล่านี้ยังระบุกลุ่มย่อยทางชีววิทยาใน AD ที่ไม่มีอาการ โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้เป็นขั้นตอนที่น่าหวังสำหรับเครื่องมือไบโอมาร์คเกอร์บนเว็บสำหรับการใช้งานทางคลินิกใน AD
โรคอัลไซเมอร์ (AD) เป็นสาเหตุที่พบบ่อยที่สุดของภาวะสมองเสื่อมของระบบประสาททั่วโลก และมีลักษณะเฉพาะจากความผิดปกติของระบบทางชีววิทยาที่หลากหลาย รวมถึงการถ่ายทอดผ่านไซแนปติก ภูมิคุ้มกันแบบอาศัยไกลเดียต และเมแทบอลิซึมของไมโตคอนเดรีย (1-3) อย่างไรก็ตาม ตัวชี้วัดทางชีวภาพด้านโปรตีนที่จัดตั้งขึ้นยังคงมุ่งเน้นไปที่การตรวจหาโปรตีนอะไมลอยด์และเทา ดังนั้นจึงไม่สามารถสะท้อนถึงพยาธิสรีรวิทยาที่หลากหลายนี้ได้ ตัวชี้วัดทางชีวภาพของโปรตีน "แกนกลาง" เหล่านี้ที่ตรวจวัดได้อย่างน่าเชื่อถือที่สุดในน้ำไขสันหลัง (CSF) ได้แก่ (i) อะไมลอยด์เบตาเปปไทด์ 1-42 (Aβ1-42) ซึ่งสะท้อนถึงการก่อตัวของแผ่นอะไมลอยด์ในเยื่อหุ้มสมอง; (ii) เอกภาพทั้งหมด ซึ่งเป็นสัญญาณของการเสื่อมของแอกซอน; (iii) ฟอสโฟ-เทา (p-tau) ซึ่งเป็นตัวแทนของพยาธิวิทยาเทาว์ไฮเปอร์ฟอสโฟรีเลชั่น (4-7) แม้ว่าตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของน้ำไขสันหลังเหล่านี้จะอำนวยความสะดวกในการตรวจหาโรคโปรตีน AD ที่ "ทำเครื่องหมาย" (4-7) อย่างมาก แต่ก็เป็นเพียงส่วนเล็ก ๆ ของชีววิทยาที่ซับซ้อนที่อยู่เบื้องหลังโรคนี้
การขาดความหลากหลายทางพยาธิสรีรวิทยาของตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของ AD ได้นำไปสู่ความท้าทายมากมาย ซึ่งรวมถึง (i) การไร้ความสามารถในการระบุและหาปริมาณความแตกต่างทางชีวภาพของผู้ป่วย AD (ii) การวัดความรุนแรงและการลุกลามของโรคไม่เพียงพอ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในระยะพรีคลินิก และ ( iii) การพัฒนายารักษาโรคที่ล้มเหลวในการแก้ปัญหาการเสื่อมสภาพของระบบประสาททุกด้านอย่างสมบูรณ์ การพึ่งพาพยาธิวิทยาที่สำคัญของเราในการอธิบาย AD จากโรคที่เกี่ยวข้องทำให้ปัญหาเหล่านี้รุนแรงขึ้นเท่านั้น มีหลักฐานมากขึ้นเรื่อยๆ แสดงให้เห็นว่าผู้สูงอายุส่วนใหญ่ที่มีภาวะสมองเสื่อมมีลักษณะทางพยาธิสภาพของความเสื่อมทางสติปัญญามากกว่าหนึ่งลักษณะ (8) บุคคลที่มีโรค AD มากถึง 90% ขึ้นไปก็มีโรคหลอดเลือด รวม TDP-43 หรือโรคความเสื่อมอื่น ๆ (9) การทับซ้อนทางพยาธิวิทยาในสัดส่วนที่สูงเหล่านี้ได้รบกวนกรอบการวินิจฉัยโรคสมองเสื่อมในปัจจุบันของเรา และจำเป็นต้องมีคำจำกัดความทางพยาธิสรีรวิทยาที่ครอบคลุมมากขึ้น
เมื่อพิจารณาถึงความจำเป็นเร่งด่วนสำหรับตัวบ่งชี้ทางชีวภาพ AD ที่หลากหลาย สาขาวิชานี้จึงนำวิธี "omics" มาใช้มากขึ้นเรื่อยๆ โดยอิงตามระบบโดยรวมในการค้นหาตัวบ่งชี้ทางชีวภาพ Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance เปิดตัวในปี 2014 และอยู่ในแนวหน้าของโครงการ ความพยายามแบบสหสาขาวิชาชีพโดยสถาบันสุขภาพ นักวิชาการ และอุตสาหกรรมแห่งชาติ มีเป้าหมายที่จะใช้กลยุทธ์ที่อิงระบบเพื่อกำหนดพยาธิสรีรวิทยาของ AD ได้ดีขึ้น และพัฒนากลยุทธ์การวิเคราะห์และการรักษาความหลากหลายทางชีวภาพ (10) ในฐานะที่เป็นส่วนหนึ่งของโครงการนี้ โปรตีโอมิกส์ของเครือข่ายได้กลายเป็นเครื่องมือที่มีแนวโน้มสำหรับความก้าวหน้าของตัวชี้วัดทางชีวภาพแบบระบบใน AD แนวทางที่ขับเคลื่อนด้วยข้อมูลที่เป็นกลางนี้จัดชุดข้อมูลโปรตีโอมิกส์ที่ซับซ้อนออกเป็นกลุ่มหรือ "โมดูล" ของโปรตีนที่แสดงออกร่วมกันซึ่งเกี่ยวข้องกับประเภทเซลล์เฉพาะ ออร์แกเนลล์ และการทำงานทางชีววิทยา (11-13) มีการศึกษาโปรตีโอมิกส์เครือข่ายที่อุดมด้วยข้อมูลเกือบ 12 ครั้งในสมอง AD (13-23) โดยรวมแล้ว การวิเคราะห์เหล่านี้บ่งชี้ว่าโปรตีโอมของเครือข่ายสมอง AD ยังคงรักษาองค์กรแบบโมดูลาร์ที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้อย่างสูงในกลุ่มประชากรที่เป็นอิสระและบริเวณเยื่อหุ้มสมองหลายแห่ง นอกจากนี้ โมดูลเหล่านี้บางส่วนยังแสดงการเปลี่ยนแปลงที่ทำซ้ำได้ในความอุดมสมบูรณ์ที่เกี่ยวข้องกับ AD ในชุดข้อมูล ซึ่งสะท้อนถึงพยาธิสรีรวิทยาของโรคหลายชนิด โดยรวมแล้ว การค้นพบเหล่านี้แสดงให้เห็นถึงจุดยึดที่มีแนวโน้มสำหรับการค้นพบโปรตีโอมของเครือข่ายสมองในฐานะไบโอมาร์คเกอร์ที่อิงระบบใน AD
เพื่อที่จะเปลี่ยนโปรตีโอมของเครือข่ายสมอง AD ให้กลายเป็นไบโอมาร์คเกอร์ที่มีประโยชน์ทางคลินิก เราได้รวมเครือข่ายที่ได้มาจากสมองเข้ากับการวิเคราะห์โปรตีโอมิกของ AD CSF วิธีการบูรณาการนี้นำไปสู่การระบุชุดตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของ CSF ห้าชุดที่มีศักยภาพ ซึ่งเกี่ยวข้องกับพยาธิสรีรวิทยาที่มีพื้นฐานมาจากสมองที่หลากหลาย รวมถึงไซแนปส์ หลอดเลือด การเกิดไมอีลิน การอักเสบ และความผิดปกติของวิถีทางเมแทบอลิซึม เราประสบความสำเร็จในการตรวจสอบแผงตัวบ่งชี้ทางชีวภาพเหล่านี้ผ่านการวิเคราะห์การจำลองแบบหลายครั้ง ซึ่งรวมถึงตัวอย่าง CSF มากกว่า 500 ตัวอย่างจากโรคทางระบบประสาทต่างๆ การวิเคราะห์การตรวจสอบความถูกต้องเหล่านี้รวมถึงการตรวจสอบเป้าหมายกลุ่มในน้ำไขสันหลังของผู้ป่วยที่มี AD ที่ไม่มีอาการ (AsymAD) หรือแสดงหลักฐานของการสะสมของอะไมลอยด์ที่ผิดปกติในสภาพแวดล้อมการรับรู้ปกติ การวิเคราะห์เหล่านี้เน้นย้ำความแตกต่างทางชีวภาพที่มีนัยสำคัญในประชากร AsymAD และระบุเครื่องหมายแผงที่อาจสามารถพิมพ์ย่อยบุคคลได้ในระยะเริ่มแรกของโรค โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงถึงขั้นตอนสำคัญในการพัฒนาเครื่องมือไบโอมาร์คเกอร์โปรตีนโดยใช้ระบบต่างๆ ที่สามารถแก้ไขปัญหาท้าทายทางคลินิกหลายอย่างที่ AD เผชิญได้สำเร็จ
วัตถุประสงค์หลักของการศึกษานี้คือเพื่อระบุตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของน้ำไขสันหลังใหม่ที่สะท้อนถึงพยาธิสรีรวิทยาในสมองต่างๆ ที่นำไปสู่ ​​AD รูปที่ S1 สรุปวิธีการวิจัยของเราซึ่งรวมถึง (i) การวิเคราะห์ที่ครอบคลุมซึ่งขับเคลื่อนโดยการค้นพบเบื้องต้นของ AD CSF และโปรตีโอมสมองในเครือข่ายเพื่อระบุตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของโรค CSF ที่เกี่ยวข้องกับสมองหลายตัว และ (ii) การจำลองแบบในภายหลัง ตัวบ่งชี้ทางชีวภาพเหล่านี้อยู่ในสมองไขสันหลังอิสระหลายแห่ง กลุ่มประชากรตามของเหลว การวิจัยที่มุ่งเน้นการค้นพบเริ่มต้นด้วยการวิเคราะห์การแสดงออกที่แตกต่างกันของ CSF ในบุคคลปกติทางสติปัญญา 20 ราย และผู้ป่วย AD 20 ราย ที่ศูนย์วิจัยโรคอัลไซเมอร์ของ Emory Goizueta (ADRC) การวินิจฉัยโรค AD หมายถึงความบกพร่องทางสติปัญญาที่มีนัยสำคัญเมื่อมี Aβ1-42 ต่ำ และระดับเทาว์และ p-tau ทั้งหมดที่เพิ่มขึ้นในน้ำไขสันหลัง [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA) )]] (ตาราง S1A) กลุ่มควบคุม (ค่าเฉลี่ย MoCA, 26.7 ± 2.2) มีตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของ CSF ในระดับปกติ
CSF ของมนุษย์มีลักษณะพิเศษคือช่วงไดนามิกของความอุดมสมบูรณ์ของโปรตีน ซึ่งอัลบูมินและโปรตีนที่มีปริมาณมากอื่นๆ สามารถป้องกันการตรวจพบโปรตีนที่สนใจได้ (24) เพื่อเพิ่มความลึกของการค้นพบโปรตีน เราได้ลบโปรตีนที่มีปริมาณมาก 14 รายการแรกออกจากตัวอย่าง CSF แต่ละตัวอย่างก่อนการวิเคราะห์แมสสเปกโตรเมทรี (MS) (24) MS ระบุเปปไทด์ทั้งหมด 39,805 รายการ ซึ่งแมปกับโปรตีโอม 3691 ตัวใน 40 ตัวอย่าง การหาปริมาณโปรตีนดำเนินการโดยการติดฉลากแท็กมวลหลายคู่ (TMT) (18, 25) เพื่อแก้ไขข้อมูลที่ขาดหายไป เราได้รวมเฉพาะโปรตีนเหล่านั้นที่ได้รับการวัดปริมาณในตัวอย่างอย่างน้อย 50% ในการวิเคราะห์ครั้งต่อไป ดังนั้นในที่สุดจึงวัดปริมาณโปรตีโอมได้ 2,875 ตัว เนื่องจากความแตกต่างที่มีนัยสำคัญในระดับความอุดมสมบูรณ์ของโปรตีนทั้งหมด ตัวอย่างควบคุมจึงถูกพิจารณาว่ามีค่าผิดปกติ (13) ทางสถิติ และไม่ได้รวมอยู่ในการวิเคราะห์ในภายหลัง ค่าความอุดมสมบูรณ์ของตัวอย่างที่เหลือ 39 ตัวอย่าง ถูกปรับตามอายุ เพศ และความแปรปรวนร่วมแบบแบทช์ (13-15, 17, 18, 20, 26)
การใช้การวิเคราะห์การทดสอบทีทางสถิติเพื่อประเมินการแสดงออกที่แตกต่างกันบนชุดข้อมูลการถดถอย การวิเคราะห์นี้ระบุโปรตีนที่ระดับความอุดมสมบูรณ์มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญ (P <0.05) ระหว่างกลุ่มควบคุมและกรณี AD (ตาราง S2A) ดังที่แสดงในรูปที่ 1A ความอุดมสมบูรณ์ของโปรตีนทั้งหมด 225 รายการใน AD ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ และความอุดมสมบูรณ์ของโปรตีน 303 รายการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ โปรตีนที่แสดงออกแตกต่างกันเหล่านี้รวมถึงเครื่องหมาย AD ของน้ำไขสันหลังที่ระบุก่อนหน้านี้หลายอย่าง เช่นโปรตีนเทาว์ที่เกี่ยวข้องกับไมโครทูบูล (MAPT; P = 3.52 × 10−8), เส้นใยประสาท (NEFL; P = 6.56 × 10−3), โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการเจริญเติบโต 43 (GAP43; P = 1.46 × 10−5), โปรตีนจับกรดไขมัน 3 (FABP3; P = 2.00 × 10−5), ไคติเนส 3 เช่น 1 (CHI3L1; P = 4.44 × 10−6), Neural Granulin (NRGN; P = 3.43 × 10−4) และปัจจัยการเจริญเติบโตของเส้นประสาท VGF (VGF; P = 4.83 × 10−3) (4-6) อย่างไรก็ตาม เรายังระบุเป้าหมายที่สำคัญมากอื่น ๆ เช่น ตัวยับยั้งการแยกตัวของ GDP 1 (GDI1; P = 1.54 × 10-10) และการจับแคลเซียมแบบโมดูลาร์ที่เกี่ยวข้องกับ SPARC 1 (SMOC1; P = 6.93 × 10-9) การวิเคราะห์ Gene Ontology (GO) ของโปรตีนที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ 225 ชนิดเผยให้เห็นการเชื่อมต่ออย่างใกล้ชิดกับกระบวนการของเหลวในร่างกาย เช่น เมแทบอลิซึมของสเตียรอยด์ การแข็งตัวของเลือด และกิจกรรมของฮอร์โมน (รูปที่ 1B และตาราง S2B) ในทางตรงกันข้าม โปรตีนที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของ 303 มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับโครงสร้างของเซลล์และการเผาผลาญพลังงาน
( A ) พล็อตภูเขาไฟแสดงการเปลี่ยนแปลงของ log2 fold (แกน x) สัมพันธ์กับค่า P ทางสถิติ -log10 (แกน y) ที่ได้รับจากการทดสอบ t ซึ่งใช้ในการตรวจจับการแสดงออกที่แตกต่างกันระหว่างการควบคุม (CT) และ กรณี AD ของโปรตีโอม CSF ของโปรตีนทั้งหมด โปรตีนที่มีระดับลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (P <0.05) ใน AD จะแสดงเป็นสีน้ำเงิน ในขณะที่โปรตีนที่มีระดับโรคเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญจะแสดงเป็นสีแดง โปรตีนที่เลือกมีป้ายกำกับ (B) คำศัพท์ GO ยอดนิยมที่เกี่ยวข้องกับโปรตีนจะลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (สีน้ำเงิน) และเพิ่มขึ้น (สีแดง) ใน AD แสดงคำศัพท์ GO สามคำที่มีคะแนน z สูงสุดในด้านกระบวนการทางชีววิทยา หน้าที่ของโมเลกุล และส่วนประกอบของเซลล์ (C) MS วัดระดับ MAPT ในตัวอย่าง CSF (ซ้าย) และความสัมพันธ์กับระดับตัวอย่าง ELISA tau (ขวา) ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์เพียร์สันกับค่า P ที่เกี่ยวข้องจะปรากฏขึ้น เนื่องจากขาดข้อมูล ELISA สำหรับกรณี AD หนึ่งกรณี ตัวเลขเหล่านี้จึงรวมค่าสำหรับ 38 กรณีจากการวิเคราะห์ 39 กรณี (D) การวิเคราะห์คลัสเตอร์ภายใต้การดูแล (P <0.0001, Benjamini-Hochberg (BH) ปรับ P <0.01) บนตัวควบคุมและ AD CSF พบตัวอย่างโดยใช้โปรตีนที่เปลี่ยนแปลงที่สำคัญที่สุด 65 รายการในชุดข้อมูล ทำให้เป็นมาตรฐาน ทำให้เป็นมาตรฐาน
ระดับโปรตีโอมิกของ MAPT มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับระดับ ELISA tau ที่วัดได้โดยอิสระ (r = 0.78, P = 7.8 × 10-9; รูปที่ 1C) ซึ่งสนับสนุนความถูกต้องของการวัด MS ของเรา หลังจากการย่อยทริปซินที่ระดับโปรตีนสารตั้งต้นของอะไมลอยด์ (APP) เปปไทด์เฉพาะของไอโซฟอร์มที่แมปกับปลาย C ของ Aβ1-40 และ Aβ1-42 จะไม่สามารถแตกตัวเป็นไอออนได้อย่างมีประสิทธิภาพ (27, 28) ดังนั้นเปปไทด์ของ APP ที่เราระบุจึงไม่เกี่ยวข้องกับระดับ ELISA Aβ1-42 เพื่อประเมินการแสดงออกที่แตกต่างกันของแต่ละกรณี เราใช้โปรตีนที่แสดงออกแตกต่างกันด้วย P <0.0001 [อัตราการค้นพบที่ผิดพลาด (FDR) แก้ไข P <0.01] เพื่อทำการวิเคราะห์คลัสเตอร์ภายใต้การดูแลของตัวอย่าง (ตาราง S2A) ดังที่แสดงในรูปที่ 1D โปรตีนที่มีนัยสำคัญสูง 65 ชนิดเหล่านี้สามารถจัดกลุ่มตัวอย่างตามสถานะของโรคได้อย่างถูกต้อง ยกเว้นกรณี AD หนึ่งกรณีที่มีลักษณะคล้ายการควบคุม จากโปรตีน 65 ชนิดนี้ มี AD เพิ่มขึ้น 63 รายการ ในขณะที่มีเพียง 2 รายการ (CD74 และ ISLR) เท่านั้นที่ลดลง โดยรวมแล้ว การวิเคราะห์น้ำไขสันหลังเหล่านี้ได้ระบุโปรตีนหลายร้อยชนิดใน AD ที่อาจทำหน้าที่เป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของโรค
จากนั้นเราทำการวิเคราะห์เครือข่ายอิสระของโปรตีโอมสมอง AD กลุ่มสมองของการค้นพบนี้รวมถึงเยื่อหุ้มสมองส่วนหน้าส่วนหน้า dorsolateral (DLPFC) จากกลุ่มควบคุม (n = 10), โรคพาร์กินสัน (PD; n = 10), กรณี AD/PD แบบผสม (n = 10) และ AD (n = 10) ) ตัวอย่าง เอเมรี่ โกอิซูต้า ADRC ข้อมูลประชากรของ 40 กรณีเหล่านี้ได้รับการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (25) และสรุปไว้ในตาราง S1B เราใช้ TMT-MS เพื่อวิเคราะห์เนื้อเยื่อสมอง 40 ชิ้นนี้และกลุ่มการจำลองแบบของ 27 ราย โดยรวมแล้ว ชุดข้อมูลสมองทั้งสองชุดนี้ผลิตเปปไทด์ที่มีเอกลักษณ์เฉพาะตัวได้ 227,121 ตัว ซึ่งจับคู่กับโปรตีโอม 12,943 ตัว (25 ตัว) เฉพาะโปรตีนเหล่านั้นที่ถูกตรวจวัดปริมาณในกรณีอย่างน้อย 50% เท่านั้นที่ถูกรวมไว้ในการตรวจสอบครั้งต่อไป ชุดข้อมูลการค้นพบขั้นสุดท้ายประกอบด้วยโปรตีนเชิงปริมาณ 8817 ตัว ปรับระดับความอุดมสมบูรณ์ของโปรตีนตามอายุ เพศ และช่วงเวลาหลังชันสูตร (PMI) การวิเคราะห์การแสดงออกเชิงอนุพันธ์ของชุดข้อมูลหลังการถดถอยแสดงให้เห็นว่าระดับโปรตีน >2000 มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญ [P <0.05, การวิเคราะห์ความแปรปรวน (ANOVA)] ในกลุ่มโรคสองกลุ่มขึ้นไป จากนั้น เราทำการวิเคราะห์คลัสเตอร์ภายใต้การดูแลโดยยึดตามโปรตีนที่แสดงออกแตกต่างกัน และ P <0.0001 ในการเปรียบเทียบ AD/การควบคุม และ/หรือ AD/PD (รูปที่ S2, A และ B, ตาราง S2C) โปรตีนที่มีการเปลี่ยนแปลงสูง 165 ชนิดเหล่านี้แสดงให้เห็นอย่างชัดเจนถึงกรณีที่มีพยาธิสภาพของ AD จากกลุ่มควบคุมและตัวอย่าง PD ซึ่งยืนยันถึงการเปลี่ยนแปลงเฉพาะของ AD ที่รุนแรงในโปรตีโอมทั้งหมด
จากนั้นเราใช้อัลกอริทึมที่เรียกว่า Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) เพื่อทำการวิเคราะห์เครือข่ายบนโปรตีโอมของสมองที่ค้นพบ ซึ่งจัดระเบียบชุดข้อมูลลงในโมดูลโปรตีนที่มีรูปแบบการแสดงออกที่คล้ายกัน (11-13) การวิเคราะห์ระบุโปรตีนที่แสดงออกร่วมกัน 44 โมดูล (M) จัดเรียงและเรียงลำดับจากโปรตีนที่ใหญ่ที่สุด (M1, n = 1821 โปรตีน) จนถึงโปรตีนที่เล็กที่สุด (M44, n = 34 โปรตีน) (รูปที่ 2A และตาราง S2D) ตามที่กล่าวไว้ข้างต้น (13) คำนวณโปรไฟล์การแสดงออกที่เป็นตัวแทนหรือโปรตีนที่มีลักษณะเฉพาะของแต่ละโมดูล และสัมพันธ์กับสภาวะของโรคและพยาธิวิทยาของ AD กล่าวคือ สร้างพันธมิตรระหว่าง Alzheimer's Disease Registry (CERAD) และ Braak Score (รูปที่ 2B) โดยรวมแล้ว 17 โมดูลมีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญกับโรคระบบประสาทของ AD (P <0.05) โมดูลที่เกี่ยวข้องกับโรคเหล่านี้จำนวนมากยังมีเครื่องหมายเฉพาะประเภทเซลล์อยู่มากมาย (รูปที่ 2B) ตามที่กล่าวไว้ข้างต้น (13) การเพิ่มคุณค่าประเภทเซลล์ถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์การทับซ้อนของโมดูลและรายการอ้างอิงของยีนเฉพาะประเภทเซลล์ ยีนเหล่านี้ได้มาจากข้อมูลที่เผยแพร่ในเซลล์ประสาทของเมาส์ที่แยกเดี่ยว เซลล์บุผนังหลอดเลือด และเซลล์เกลีย การทดลองลำดับ RNA (RNA-seq) (29)
(A) ค้นหา WGCNA ของโปรตีโอมในสมอง ( B ) การวิเคราะห์ Biweight midcorrelation (BiCor) ของโปรตีนลายเซ็นแบบโมดูลาร์ (องค์ประกอบหลักแรกของการแสดงออกของโปรตีนแบบโมดูลาร์) ที่มีลักษณะทางระบบประสาทของ AD (บนสุด) รวมถึงคะแนน CERAD (Aβ plaque) และ Braak (tau tangles) ความเข้มของความสัมพันธ์เชิงบวก (สีแดง) และลบ (สีน้ำเงิน) แสดงโดยแผนที่ความร้อนสองสี และเครื่องหมายดอกจันบ่งบอกถึงนัยสำคัญทางสถิติ (P <0.05) ใช้การทดสอบที่แน่นอนของฟิชเชอร์ไฮเปอร์จีโอเมตริก (FET) (ด้านล่าง) เพื่อประเมินการเชื่อมโยงประเภทเซลล์ของโมดูลโปรตีนแต่ละโมดูล ความเข้มของการแรเงาสีแดงบ่งบอกถึงระดับการเพิ่มคุณค่าของประเภทเซลล์ และเครื่องหมายดอกจันบ่งบอกถึงนัยสำคัญทางสถิติ (P <0.05) ใช้วิธี BH เพื่อแก้ไขค่า P ที่ได้มาจาก FET ( C ) การวิเคราะห์ GO ของโปรตีนโมดูลาร์ กระบวนการทางชีวภาพที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดที่สุดจะแสดงสำหรับแต่ละโมดูลหรือกลุ่มโมดูลที่เกี่ยวข้อง โอลิโก, โอลิโกเดนโดรไซต์
ชุดของแอสโตรไซต์ห้าโมดูลที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดและโมดูลที่อุดมด้วย microglia (M30, M29, M18, M24 และ M5) แสดงความสัมพันธ์เชิงบวกที่แข็งแกร่งกับโรคระบบประสาทของ AD (รูปที่ 2B) การวิเคราะห์อภิปรัชญาเชื่อมโยงโมดูล glial เหล่านี้กับการเจริญเติบโตของเซลล์ การเพิ่มจำนวน และภูมิคุ้มกัน (รูปที่ 2C และตาราง S2E) โมดูล glial เพิ่มเติมอีกสองโมดูล ได้แก่ M8 และ M22 ได้รับการควบคุมโรคอย่างรุนแรงเช่นกัน M8 มีความสัมพันธ์อย่างมากกับทางเดินของตัวรับที่มีลักษณะคล้ายค่าผ่านทาง ซึ่งเป็นสัญญาณส่งสัญญาณที่มีบทบาทสำคัญในการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันโดยธรรมชาติ (30) ในเวลาเดียวกัน M22 มีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับการแก้ไขหลังการแปล M2 ซึ่งอุดมไปด้วย oligodendrocytes แสดงความสัมพันธ์เชิงบวกที่แข็งแกร่งกับพยาธิวิทยาของ AD และการเชื่อมต่อทางภววิทยากับการสังเคราะห์นิวคลีโอไซด์และการจำลองแบบ DNA ซึ่งบ่งชี้ถึงการเพิ่มจำนวนเซลล์ในโรคต่างๆ โดยรวมแล้วการค้นพบเหล่านี้สนับสนุนการยกระดับโมดูล glial ที่เราเคยพบเห็นในโปรตีโอเครือข่าย AD (13, 17) ปัจจุบันพบว่าโมดูล glial ที่เกี่ยวข้องกับ AD จำนวนมากในเครือข่ายแสดงระดับการแสดงออกที่ต่ำกว่าในกรณีควบคุมและ PD โดยเน้นถึงความจำเพาะของโรคที่เพิ่มขึ้นใน AD (รูปที่ S2C)
มีเพียงสี่โมดูลในโปรตีโอมเครือข่ายของเรา (M1, M3, M10 และ M32) เท่านั้นที่มีความสัมพันธ์เชิงลบอย่างยิ่งกับพยาธิวิทยาของ AD ( P <0.05) (รูปที่ 2, B และ C) ทั้ง M1 และ M3 อุดมไปด้วยเครื่องหมายของเส้นประสาท M1 มีความสัมพันธ์อย่างมากกับสัญญาณซินแนปติก ในขณะที่ M3 มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับการทำงานของไมโตคอนเดรีย ไม่มีหลักฐานการเพิ่มคุณค่าประเภทเซลล์สำหรับ M10 และ M32 M32 สะท้อนถึงความเชื่อมโยงระหว่าง M3 และเมแทบอลิซึมของเซลล์ ในขณะที่ M10 มีความสัมพันธ์อย่างมากกับการเติบโตของเซลล์และการทำงานของไมโครทูบูล เมื่อเปรียบเทียบกับ AD ทั้งสี่โมดูลจะเพิ่มขึ้นในการควบคุมและ PD ทำให้มีการเปลี่ยนแปลง AD เฉพาะโรค (รูปที่ S2C) โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้สนับสนุนโมดูลที่อุดมด้วยเซลล์ประสาทจำนวนมากที่ลดลงซึ่งเราเคยพบเห็นใน AD (13, 17) โดยสรุป การวิเคราะห์เครือข่ายของโปรตีโอมในสมองที่เราค้นพบนั้นสร้างโมดูลที่ปรับเปลี่ยนเฉพาะโฆษณาซึ่งสอดคล้องกับการค้นพบครั้งก่อนของเรา
AD มีลักษณะเป็นระยะที่ไม่มีอาการ (AsymAD) ซึ่งบุคคลแสดงการสะสมของอะไมลอยด์โดยไม่มีการเสื่อมถอยของการรับรู้ทางคลินิก (5, 31) ระยะที่ไม่มีอาการนี้เป็นช่วงวิกฤตสำหรับการตรวจหาและการแทรกแซงตั้งแต่เนิ่นๆ ก่อนหน้านี้เราได้แสดงให้เห็นการเก็บรักษาแบบแยกส่วนที่แข็งแกร่งของโปรตีนเครือข่ายสมอง AsymAD และ AD ข้ามชุดข้อมูลที่เป็นอิสระ (13, 17) เพื่อให้แน่ใจว่าเครือข่ายสมองที่เราค้นพบในปัจจุบันสอดคล้องกับการค้นพบก่อนหน้านี้ เราได้วิเคราะห์การเก็บรักษา 44 โมดูลในชุดข้อมูลที่จำลองแบบจากองค์กร DLPFC 27 แห่ง องค์กรเหล่านี้รวมถึงกรณีการควบคุม (n = 10), AsymAD (n = 8) และ AD (n = 9) ตัวอย่างการควบคุมและ AD ถูกรวมอยู่ในการวิเคราะห์กลุ่มสมองการค้นพบของเรา (ตาราง S1B) ในขณะที่กรณี AsymAD นั้นไม่ซ้ำกันในกลุ่มการจำลองแบบเท่านั้น กรณี AsymAD เหล่านี้มาจากธนาคารสมอง Emory Goizueta ADRC แม้ว่าการรับรู้จะเป็นเรื่องปกติในขณะที่เสียชีวิต แต่ระดับอะไมลอยด์ก็สูงผิดปกติ (เฉลี่ย CERAD, 2.8 ± 0.5) (ตาราง S1B)
การวิเคราะห์ TMT-MS ของเนื้อเยื่อสมอง 27 ชิ้นนี้ส่งผลให้มีปริมาณโปรตีโอม 11,244 ชิ้น การนับครั้งสุดท้ายนี้รวมเฉพาะโปรตีนเหล่านั้นซึ่งวัดปริมาณในตัวอย่างอย่างน้อย 50% ชุดข้อมูลที่จำลองแบบนี้ประกอบด้วยโปรตีน 8817 8638 (98.0%) ที่ตรวจพบในการวิเคราะห์สมองเพื่อการค้นพบของเรา และมีการเปลี่ยนแปลงโปรตีนอย่างมีนัยสำคัญเกือบ 3,000 รายการระหว่างกลุ่มควบคุมและกลุ่ม AD ( P <0.05 หลังจากการทดสอบ paired t ของ Tukey เพื่อการวิเคราะห์ความแปรปรวน) ( ตาราง S2F) ในบรรดาโปรตีนที่แสดงออกแตกต่างกันเหล่านี้ 910 ยังแสดงการเปลี่ยนแปลงระดับที่มีนัยสำคัญระหว่าง AD และกรณีควบคุมโปรตีโอมสมอง (P <0.05 หลังจาก ANOVA Tukey จับคู่ t-test) เป็นที่น่าสังเกตว่าเครื่องหมาย 910 เหล่านี้มีความสอดคล้องอย่างมากในทิศทางของการเปลี่ยนแปลงระหว่างโปรตีโอม (r = 0.94, P <1.0 × 10-200) (รูปที่ S3A) ในบรรดาโปรตีนที่เพิ่มขึ้น โปรตีนที่มีการเปลี่ยนแปลงที่สอดคล้องกันมากที่สุดระหว่างชุดข้อมูลส่วนใหญ่เป็นสมาชิกของโมดูล M5 และ M18 ที่อุดมด้วย glial (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 และ GFAP) ในบรรดาโปรตีนที่ลดลง โปรตีนที่มีการเปลี่ยนแปลงที่สอดคล้องกันมากที่สุดนั้นเกือบทั้งหมดเป็นสมาชิกของโมดูล M1 (NPTX2, VGF และ RPH3A) ที่เกี่ยวข้องกับไซแนปส์ เรายังตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงที่เกี่ยวข้องกับ AD ของ midkine (MDK), CD44, โปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ frizzled 1 (SFRP1) และ VGF ที่หลั่งออกมาโดยการซับแบบตะวันตก (รูปที่ S3B) การวิเคราะห์การเก็บรักษาโมดูลแสดงให้เห็นว่าประมาณ 80% ของโมดูลโปรตีน (34/44) ในโปรตีโอมของสมองได้รับการอนุรักษ์อย่างมีนัยสำคัญในชุดข้อมูลการจำลองแบบ (z-score> 1.96, FDR แก้ไข P <0.05) (รูปที่ S3C) โมดูลสิบสี่โมดูลเหล่านี้ถูกสงวนไว้เป็นพิเศษระหว่างโปรตีโอมทั้งสอง (z -score> 10, FDR แก้ไข P <1.0 × 10−23) โดยรวมแล้วการค้นพบและการจำลองแบบของความสอดคล้องในระดับสูงในการแสดงออกที่แตกต่างกันและองค์ประกอบแบบแยกส่วนระหว่างโปรตีโอมในสมองเน้นย้ำถึงความสามารถในการทำซ้ำของการเปลี่ยนแปลงในโปรตีนเยื่อหุ้มสมองส่วนหน้าของ AD นอกจากนี้ยังยืนยันว่า AsymAD และโรคขั้นสูงอื่นๆ มีโครงสร้างเครือข่ายสมองที่คล้ายกันมาก
การวิเคราะห์โดยละเอียดเพิ่มเติมของการแสดงออกที่แตกต่างกันในชุดข้อมูลการจำลองแบบของสมองเน้นถึงระดับที่มีนัยสำคัญของการเปลี่ยนแปลงโปรตีน AsymAD ซึ่งรวมถึงโปรตีนที่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญทั้งหมด 151 รายการระหว่าง AsymAD และส่วนควบคุม (P <0.05) (รูปที่ S3D) สอดคล้องกับโหลดอะไมลอยด์ APP ในสมองของ AsymAD และ AD เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ MAPT มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญใน AD ซึ่งสอดคล้องกับระดับความยุ่งเหยิงที่เพิ่มขึ้นและความสัมพันธ์ที่ทราบกับความเสื่อมทางสติปัญญา (5, 7) โมดูลที่อุดมด้วย glial (M5 และ M18) สะท้อนให้เห็นอย่างมากในโปรตีนที่เพิ่มขึ้นใน AsymAD ในขณะที่โมดูล M1 ที่เกี่ยวข้องกับเซลล์ประสาทเป็นตัวแทนส่วนใหญ่ของโปรตีนที่ลดลงใน AsymAD เครื่องหมาย AsymAD เหล่านี้หลายตัวแสดงการเปลี่ยนแปลงที่มากขึ้นในโรคที่แสดงอาการ ในบรรดาเครื่องหมายเหล่านี้คือ SMOC1 ซึ่งเป็นโปรตีน glial ที่เป็นของ M18 ซึ่งเกี่ยวข้องกับเนื้องอกในสมองและการพัฒนาของดวงตาและแขนขา (32) MDK เป็นปัจจัยการเจริญเติบโตที่มีผลผูกพันกับเฮปารินซึ่งเกี่ยวข้องกับการเติบโตของเซลล์และการสร้างเส้นเลือดใหม่ (33) ซึ่งเป็นสมาชิกของ M18 อีกตัวหนึ่ง เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม AsymAD เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ตามด้วย AD เพิ่มขึ้นมากขึ้น ในทางตรงกันข้าม synaptic โปรตีน neuropentraxin 2 (NPTX2) ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในสมอง AsymAD ก่อนหน้านี้ NPTX2 เกี่ยวข้องกับการเสื่อมของระบบประสาท และมีบทบาทที่ได้รับการยอมรับในการเป็นสื่อกลางในการกระตุ้นประสาท (34) โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้เผยให้เห็นการเปลี่ยนแปลงของโปรตีนพรีคลินิกที่แตกต่างกันใน AD ซึ่งดูเหมือนจะคืบหน้าไปตามความรุนแรงของโรค
เนื่องจากเราได้รับความครอบคลุมของโปรตีนในเชิงลึกที่สำคัญในการค้นพบโปรตีโอมในสมอง เราจึงพยายามทำความเข้าใจว่ามันทับซ้อนกับทรานสคริปต์โทม AD ระดับเครือข่ายอย่างสมบูรณ์ยิ่งขึ้น ดังนั้นเราจึงเปรียบเทียบโปรตีโอมสมองที่เราค้นพบกับโมดูลที่เราสร้างขึ้นก่อนหน้านี้จากการวัดไมโครเรย์ของยีน 18,204 ยีนใน AD (n = 308) และการควบคุม (n = 157) เนื้อเยื่อ DLPFC (13) ทับซ้อนกัน โดยรวมแล้ว เราได้ระบุโมดูล RNA ที่แตกต่างกัน 20 โมดูล ซึ่งหลายโมดูลแสดงให้เห็นถึงการเพิ่มคุณค่าของเซลล์ประเภทเฉพาะ รวมถึงเซลล์ประสาท oligodendrocytes astrocytes และ microglia (รูปที่ 3A) การเปลี่ยนแปลงหลายอย่างของโมดูลเหล่านี้ใน AD แสดงในรูปที่ 3B สอดคล้องกับการวิเคราะห์การทับซ้อนของโปรตีน-RNA ก่อนหน้านี้ของเราโดยใช้โปรตีโอม MS ที่ไม่มีป้ายกำกับที่ลึกกว่า (ประมาณ 3,000 โปรตีน) (13) โมดูลส่วนใหญ่จาก 44 โมดูลในเครือข่ายโปรตีโอมสมองที่เราพบอยู่ในเครือข่ายทรานสคริปโตม ไม่มีการทับซ้อนกันที่มีนัยสำคัญ แม้แต่ใน การค้นพบและการจำลองโมดูลโปรตีน 34 โมดูลของเราซึ่งยังคงอยู่ในโปรตีโอมในสมองสูง มีเพียง 14 (~ 40%) ที่ผ่านการทดสอบที่แน่นอนของฟิชเชอร์ (FET) ซึ่งพิสูจน์แล้วว่ามีการทับซ้อนที่มีนัยสำคัญทางสถิติกับทรานสคริปต์ (รูปที่ 3A) เข้ากันได้กับการซ่อมแซมความเสียหายของ DNA (P-M25 และ P-M19), การแปลโปรตีน (P-M7 และ P-M20), การจับ/ต่อ RNA (P-M16 และ P-M21) และการกำหนดเป้าหมายโปรตีน (P-M13 และ P- M23) ไม่ทับซ้อนกับโมดูลในทรานสคริปโตม ดังนั้นถึงแม้ว่าจะใช้ชุดข้อมูลโปรตีโอมที่ลึกกว่าในการวิเคราะห์การทับซ้อนปัจจุบัน (13) แต่โปรตีโอมเครือข่าย AD ส่วนใหญ่ไม่ได้ถูกแมปกับเครือข่ายทรานสคริปโตม
(A) Hypergeometric FET แสดงให้เห็นถึงการเพิ่มคุณค่าของเครื่องหมายเฉพาะประเภทเซลล์ในโมดูล RNA ของ AD transcriptome (บนสุด) และระดับของการทับซ้อนกันระหว่าง RNA (แกน x) และโมดูลโปรตีน (แกน y) ของสมอง AD (ด้านล่าง) . ความเข้มของการแรเงาสีแดงบ่งบอกถึงระดับการเพิ่มประสิทธิภาพของประเภทเซลล์ในแผงด้านบนและความเข้มของการทับซ้อนของโมดูลในแผงด้านล่าง เครื่องหมายดอกจันบ่งบอกถึงนัยสำคัญทางสถิติ (P <0.05) ( B ) ระดับความสัมพันธ์ระหว่างยีนลักษณะเฉพาะของแต่ละโมดูลการถอดเสียงและสถานะ AD โมดูลด้านซ้ายมีความสัมพันธ์เชิงลบมากที่สุดกับ AD (สีน้ำเงิน) และโมดูลทางด้านขวามีความสัมพันธ์เชิงบวกมากที่สุดกับ AD (สีแดง) ค่า P ที่แก้ไขด้วย BH ที่เปลี่ยนรูปแบบบันทึกบ่งชี้ระดับนัยสำคัญทางสถิติของแต่ละความสัมพันธ์ (C) โมดูลที่ทับซ้อนกันอย่างมีนัยสำคัญพร้อมการเพิ่มคุณค่าประเภทเซลล์ที่ใช้ร่วมกัน ( D ) การวิเคราะห์สหสัมพันธ์ของการเปลี่ยนแปลง log2 เท่าของโปรตีนที่มีป้ายกำกับ (แกน x) และ RNA (แกน y) ในโมดูลที่ทับซ้อนกัน ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์เพียร์สันกับค่า P ที่เกี่ยวข้องจะปรากฏขึ้น ไมโคร, ไมโครเกลีย; เทห์ฟากฟ้า, แอสโตรไซต์ ซีทีควบคุม
โมดูลโปรตีนและ RNA ที่ทับซ้อนกันส่วนใหญ่แบ่งปันโปรไฟล์การเพิ่มคุณค่าประเภทเซลล์ที่คล้ายกันและทิศทางการเปลี่ยนแปลง AD ที่สอดคล้องกัน (รูปที่ 3, B และ C) กล่าวอีกนัยหนึ่ง โมดูล M1 ที่เกี่ยวข้องกับไซแนปส์ของโปรตีโอมในสมอง (PM​1) ถูกแมปกับโมดูล RNA ที่คล้ายคลึงกันซึ่งมีเซลล์ประสาทจำนวนมากสามโมดูล (R-M1, R-M9 และ R-M16) ซึ่งอยู่ใน AD ทั้งสองแสดง ระดับที่ลดลง ในทำนองเดียวกัน โมดูลโปรตีน M5 และ M18 ที่มี glial ซ้อนทับกับโมดูล RNA ที่อุดมไปด้วยแอสโตรไซต์และเครื่องหมายจุลชีพ (R-M3, R-M7 และ R-M10) และมีส่วนเกี่ยวข้องอย่างมากกับโรคต่างๆ เพิ่มขึ้น คุณสมบัติโมดูลาร์ที่ใช้ร่วมกันเหล่านี้ระหว่างชุดข้อมูลทั้งสองชุดยังสนับสนุนการเพิ่มคุณค่าประเภทเซลล์และการเปลี่ยนแปลงที่เกี่ยวข้องกับโรคที่เราสังเกตเห็นในโปรตีโอมของสมอง อย่างไรก็ตาม เราสังเกตเห็นความแตกต่างที่สำคัญมากมายระหว่าง RNA และระดับโปรตีนของเครื่องหมายแต่ละตัวในโมดูลที่ใช้ร่วมกันเหล่านี้ การวิเคราะห์สหสัมพันธ์ของการแสดงออกเชิงอนุพันธ์ของโปรตีโอมิกส์และทรานสคริปโตมิกส์ของโมเลกุลภายในโมดูลที่ทับซ้อนกันเหล่านี้ (รูปที่ 3 มิติ) เน้นย้ำถึงความไม่สอดคล้องกันนี้ ตัวอย่างเช่น APP และโปรตีนโมดูล glial อื่นๆ อีกหลายชนิด (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 และ SFRP1) แสดงให้เห็นการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในโปรตีโอม AD แต่แทบไม่มีการเปลี่ยนแปลงในทรานสคริปโตม AD การเปลี่ยนแปลงเฉพาะโปรตีนเหล่านี้อาจเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับแผ่นอะไมลอยด์ (23, 35) โดยเน้นว่าโปรตีโอมเป็นแหล่งที่มาของการเปลี่ยนแปลงทางพยาธิวิทยา และการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้อาจไม่สะท้อนให้เห็นในทรานสคริปโตม
หลังจากวิเคราะห์สมองและโปรตีโอมของ CSF อย่างอิสระที่เราค้นพบ เราได้ทำการวิเคราะห์ที่ครอบคลุมของชุดข้อมูลทั้งสองชุดเพื่อระบุตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของ AD CSF ที่เกี่ยวข้องกับพยาธิสรีรวิทยาของเครือข่ายสมอง ก่อนอื่นเราต้องกำหนดการทับซ้อนกันของโปรตีโอมทั้งสอง แม้ว่าจะเป็นที่ยอมรับกันอย่างกว้างขวางว่า CSF สะท้อนถึงการเปลี่ยนแปลงทางประสาทเคมีในสมอง AD (4) แต่ระดับที่แน่นอนของการทับซ้อนกันระหว่างสมอง AD และโปรตีโอมของ CSF ยังไม่ชัดเจน จากการเปรียบเทียบจำนวนผลิตภัณฑ์ยีนที่ใช้ร่วมกันที่ตรวจพบในโปรตีโอมทั้งสองของเรา เราพบว่าเกือบ 70% (n = 1936) ของโปรตีนที่ระบุในน้ำไขสันหลังก็ถูกวัดปริมาณในสมองด้วย (รูปที่ 4A) โปรตีนที่ทับซ้อนกันเหล่านี้ส่วนใหญ่ (n = 1,721) ถูกแมปกับหนึ่งใน 44 โมดูลการแสดงออกร่วมจากชุดข้อมูลสมองการค้นพบ (รูปที่ 4B) ตามที่คาดไว้ โมดูลสมองที่ใหญ่ที่สุดหกโมดูล (M1 ถึง M6) แสดงปริมาณ CSF ที่ทับซ้อนกันมากที่สุด อย่างไรก็ตาม มีโมดูลสมองที่เล็กกว่า (เช่น M15 และ M29) ที่มีการทับซ้อนกันในระดับสูงอย่างไม่คาดคิด ซึ่งใหญ่กว่าโมดูลสมองสองเท่าของขนาด สิ่งนี้กระตุ้นให้เราใช้วิธีการขับเคลื่อนที่มีรายละเอียดและสถิติมากขึ้นในการคำนวณการทับซ้อนกันระหว่างสมองและน้ำไขสันหลัง
(A และ B) โปรตีนที่ตรวจพบในสมองค้นพบและชุดข้อมูล CSF ทับซ้อนกัน โปรตีนที่ทับซ้อนกันเหล่านี้ส่วนใหญ่สัมพันธ์กับหนึ่งใน 44 โมดูลการแสดงออกร่วมของเครือข่ายการแสดงออกร่วมของสมอง (C) ค้นหาความทับซ้อนกันระหว่างโปรตีโอมของน้ำไขสันหลังและโปรตีโอมของโครงข่ายสมอง แต่ละแถวของแผนที่ความร้อนแสดงถึงการวิเคราะห์การทับซ้อนที่แยกจากกันของ FET ไฮเปอร์เรขาคณิต แถวบนสุดแสดงให้เห็นการทับซ้อนกัน (การแรเงาสีเทา/ดำ) ระหว่างโมดูลสมองและโปรตีโอมของ CSF ทั้งหมด บรรทัดที่สองแสดงให้เห็นว่าการทับซ้อนกันระหว่างโมดูลสมองและโปรตีน CSF (แรเงาสีแดง) ได้รับการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญใน AD (P <0.05) แถวที่สามแสดงให้เห็นว่าการทับซ้อนกันระหว่างโมดูลสมองและโปรตีน CSF (การแรเงาสีน้ำเงิน) ได้รับการควบคุมอย่างมีนัยสำคัญใน AD (P <0.05) ใช้วิธี BH เพื่อแก้ไขค่า P ที่ได้มาจาก FET (D) แผงโมดูลการพับตามการเชื่อมโยงประเภทเซลล์และเงื่อนไข GO ที่เกี่ยวข้อง แผงเหล่านี้ประกอบด้วยโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับสมองทั้งหมด 271 รายการ ซึ่งมีการแสดงออกที่แตกต่างกันอย่างมีความหมายในโปรตีโอมของ CSF
ด้วยการใช้ FET แบบหางเดียว เราประเมินความสำคัญของการทับซ้อนของโปรตีนระหว่างโปรตีโอม CSF และโมดูลสมองแต่ละตัว การวิเคราะห์พบว่าโมดูลสมองทั้งหมด 14 โมดูลในชุดข้อมูล CSF มีการทับซ้อนที่มีนัยสำคัญทางสถิติ (FDR ที่ปรับ P <0.05) และโมดูลเพิ่มเติม (M18) ซึ่งการทับซ้อนใกล้เคียงกับนัยสำคัญ (FDR ที่ปรับ P = 0.06) (รูปที่ 4C , แถวบนสุด) นอกจากนี้เรายังสนใจโมดูลที่ทับซ้อนกันอย่างมากกับโปรตีน CSF ที่แสดงออกแตกต่างกัน ดังนั้นเราจึงใช้การวิเคราะห์ FET เพิ่มเติมสองครั้งเพื่อพิจารณาว่า (i) โปรตีน CSF ใดเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน AD และ (ii) โปรตีน CSF ลดลงอย่างมีนัยสำคัญใน AD ( P <0.05, จับคู่ t ทดสอบ AD / การควบคุม) โมดูลสมองที่มีการทับซ้อนกันที่มีความหมาย ระหว่างพวกเขา ดังที่แสดงในแถวกลางและแถวล่างของรูปที่ 4C การวิเคราะห์เพิ่มเติมเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าโมดูลสมอง 8 จาก 44 โมดูลทับซ้อนกันอย่างมีนัยสำคัญกับโปรตีนที่เพิ่มใน AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 และ M38) . ) ในขณะที่มีเพียงสองโมดูล (M6 และ M15) แสดงการทับซ้อนอย่างมีความหมายกับโปรตีนที่ลดลงใน AD CSF ตามที่คาดไว้ โมดูลทั้งหมด 10 โมดูลอยู่ใน 15 โมดูลที่มีการทับซ้อนสูงสุดกับโปรตีโอม CSF ดังนั้นเราจึงสันนิษฐานว่าโมดูลทั้ง 15 โมดูลเหล่านี้เป็นแหล่งที่ให้ผลตอบแทนสูงของตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของ CSF ที่ได้มาจากสมอง AD
เราพับโมดูลที่ทับซ้อนกัน 15 โมดูลเหล่านี้ออกเป็นแผงโปรตีนขนาดใหญ่ห้าแผงโดยพิจารณาจากความใกล้เคียงในแผนภาพต้นไม้ WGCNA และการเชื่อมโยงกับประเภทเซลล์และภววิทยาของยีน (รูปที่ 4D) แผงแรกประกอบด้วยโมดูลที่อุดมไปด้วยเครื่องหมายของเซลล์ประสาทและโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไซแนปส์ (M1 และ M12) แผงไซแนปติกประกอบด้วยโปรตีนทั้งหมด 94 ตัว และระดับในโปรตีโอมของ CSF มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญ ทำให้เป็นแหล่งของเครื่องหมาย CSF ที่เกี่ยวข้องกับสมองที่ใหญ่ที่สุดในบรรดาห้าแผง กลุ่มที่สอง (M6 และ M15) แสดงให้เห็นถึงความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับเครื่องหมายเซลล์บุผนังหลอดเลือดและร่างกายของหลอดเลือด เช่น "การสมานแผล" (M6) และ "การควบคุมการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันของร่างกาย" (M15) M15 ยังเกี่ยวข้องอย่างมากกับเมแทบอลิซึมของไลโปโปรตีนซึ่งเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับเอ็นโดทีเลียม (36) แผงหลอดเลือดประกอบด้วยเครื่องหมาย CSF 34 อันที่เกี่ยวข้องกับสมอง กลุ่มที่สามประกอบด้วยโมดูล (M2 และ M4) ที่เกี่ยวข้องอย่างมีนัยสำคัญกับเครื่องหมายโอลิโกเดนโดรไซต์และการเพิ่มจำนวนเซลล์ ตัวอย่างเช่น คำศัพท์ภววิทยาระดับบนสุดของ M2 รวมถึง "การควบคุมเชิงบวกของการจำลองดีเอ็นเอ" และ "กระบวนการสังเคราะห์พิวรีน" ในขณะเดียวกัน สิ่งเหล่านั้นของ M4 รวมถึง "การเปลี่ยนสภาพเซลล์ไกลเลีย" และ "การแยกตัวของโครโมโซม" แผงไมอีลินประกอบด้วยเครื่องหมาย CSF 49 ตัวที่เกี่ยวข้องกับสมอง
กลุ่มที่สี่ประกอบด้วยโมดูลส่วนใหญ่ (M30, M29, M18, M24 และ M5) และโมดูลเกือบทั้งหมดอุดมไปด้วยเครื่องหมาย microglia และ astrocyte อย่างมีนัยสำคัญ เช่นเดียวกับแผงไมอีลิน แผงที่สี่ยังมีโมดูล (M30, M29 และ M18) ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับการเพิ่มจำนวนเซลล์ โมดูลอื่นๆ ในกลุ่มนี้มีความเกี่ยวข้องอย่างมากกับคำศัพท์ทางภูมิคุ้มกัน เช่น "กระบวนการที่ส่งผลต่อภูมิคุ้มกัน" (M5) และ "การควบคุมการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน" (M24) กลุ่มภูมิคุ้มกัน glial มีเครื่องหมาย CSF 42 ตัวที่เกี่ยวข้องกับสมอง สุดท้าย แผงสุดท้ายประกอบด้วยเครื่องหมายที่เกี่ยวข้องกับสมอง 52 ชิ้นในสี่โมดูล (M44, M3, M33 และ M38) ซึ่งทั้งหมดอยู่บนร่างกายที่เกี่ยวข้องกับการเก็บพลังงานและการเผาผลาญ โมดูลที่ใหญ่ที่สุด (M3) มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับไมโตคอนเดรียและอุดมไปด้วยเครื่องหมายเฉพาะของเซลล์ประสาท M38 เป็นหนึ่งในโมดูลที่เล็กกว่าในเมตาโบโลมนี้ และยังแสดงความจำเพาะของเซลล์ประสาทในระดับปานกลางอีกด้วย
โดยรวมแล้ว แผงทั้งห้านี้สะท้อนถึงประเภทเซลล์และการทำงานที่หลากหลายในคอร์เทกซ์ AD และโดยรวมมีเครื่องหมาย CSF ที่เกี่ยวข้องกับสมอง 271 อัน (ตาราง S2G) เพื่อประเมินความถูกต้องของผลลัพธ์ MS เหล่านี้ เราใช้ Proximity Extension Assay (PEA) ซึ่งเป็นเทคโนโลยีที่ใช้แอนติบอดีตั้งฉากที่มีความสามารถในการมัลติเพล็กซ์ มีความไวและความจำเพาะสูง และวิเคราะห์ตัวอย่างน้ำไขสันหลังอีกครั้งซึ่งเราพบชุดย่อยของตัวบ่งชี้ทางชีวภาพ 271 รายการเหล่านี้ (น = 36) เป้าหมาย 36 ประการเหล่านี้แสดงให้เห็นถึงการเปลี่ยนแปลงใน AD Multiple ของ PEA ซึ่งเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับการค้นพบโดยใช้ MS ของเรา (r = 0.87, P = 5.6 × 10-12) ซึ่งตรวจสอบผลลัพธ์ของการวิเคราะห์ MS ที่ครอบคลุมของเราอย่างยิ่ง (รูปที่ S4 ).
หัวข้อทางชีววิทยาที่เน้นโดยกลุ่มทั้งห้าของเรา ตั้งแต่การส่งสัญญาณซินแนปติกไปจนถึงการเผาผลาญพลังงาน ล้วนเกี่ยวข้องกับการเกิดโรคของ AD (1-3) ดังนั้นโมดูลทั้งหมด 15 โมดูลที่มีแผงเหล่านี้จึงเกี่ยวข้องกับพยาธิวิทยาของ AD ในโปรตีโอมของสมองที่เราค้นพบ (รูปที่ 2B) สิ่งที่น่าสังเกตมากที่สุดคือความสัมพันธ์ทางพยาธิวิทยาเชิงบวกในระดับสูงระหว่างโมดูล glial ของเรา และความสัมพันธ์ทางพยาธิวิทยาเชิงลบที่แข็งแกร่งระหว่างโมดูลเซลล์ประสาทที่ใหญ่ที่สุดของเรา (M1 และ M3) การวิเคราะห์การแสดงออกที่แตกต่างกันของโปรตีโอมในสมองที่ถูกจำลองของเรา (รูปที่ S3D) ยังเน้นย้ำโปรตีน glial ที่ได้มาจาก M5 และ M18 ใน AsymAD และ AD ที่มีอาการ โปรตีน glial ที่เพิ่มขึ้นมากที่สุดและไซแนปส์ที่เกี่ยวข้องกับ M1 โปรตีนจะลดลงมากที่สุด การสังเกตเหล่านี้บ่งชี้ว่าเครื่องหมายน้ำไขสันหลัง 271 รายการที่เราระบุในห้ากลุ่มนั้นเกี่ยวข้องกับกระบวนการของโรคในเยื่อหุ้มสมอง AD รวมถึงที่เกิดขึ้นในระยะแรกที่ไม่มีอาการ
เพื่อที่จะวิเคราะห์ทิศทางการเปลี่ยนแปลงของโปรตีนแผงในสมองและน้ำไขสันหลังได้ดีขึ้น เราได้วาดสิ่งต่อไปนี้สำหรับแต่ละโมดูลจาก 15 โมดูลที่ทับซ้อนกัน: (i) พบระดับความอุดมสมบูรณ์ของโมดูลในชุดข้อมูลสมอง และ (ii) โมดูล โปรตีน ความแตกต่างแสดงอยู่ในน้ำไขสันหลัง (รูปที่ S5) ดังที่ได้กล่าวไว้ก่อนหน้านี้ WGCNA ใช้เพื่อกำหนดความอุดมสมบูรณ์ของโมดูลหรือค่าโปรตีนที่มีลักษณะเฉพาะในสมอง (13) แผนที่ภูเขาไฟใช้เพื่ออธิบายการแสดงออกที่แตกต่างกันของโปรตีนโมดูลาร์ในน้ำไขสันหลัง (AD/การควบคุม) ตัวเลขเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าสามในห้าแผงแสดงแนวโน้มการแสดงออกที่แตกต่างกันในสมองและไขสันหลัง โมดูลทั้งสองของแผงไซแนปส์ (M1 และ M12) แสดงระดับความอุดมสมบูรณ์ในสมอง AD ที่ลดลง แต่ทับซ้อนอย่างมีนัยสำคัญกับโปรตีนที่เพิ่มขึ้นใน AD CSF (รูปที่ S5A) โมดูลที่เกี่ยวข้องกับเซลล์ประสาทที่มีเมตาโบโลม (M3 และ M38) แสดงรูปแบบการแสดงออกของสมองและน้ำไขสันหลังที่คล้ายกันไม่สอดคล้องกัน (รูปที่ S5E) แผงหลอดเลือดยังแสดงแนวโน้มการแสดงออกที่แตกต่างกัน แม้ว่าโมดูลของมัน (M6 และ M15) จะเพิ่มขึ้นปานกลางในสมอง AD และลดลงใน CSF ที่เป็นโรค (รูปที่ S5B) สองแผงที่เหลือมีเครือข่าย glial ขนาดใหญ่ซึ่งมีโปรตีนได้รับการควบคุมอย่างสม่ำเสมอในทั้งสองช่อง (รูปที่ S5, C และ D)
โปรดทราบว่าแนวโน้มเหล่านี้ไม่ได้เกิดขึ้นกับเครื่องหมายทั้งหมดในแผงเหล่านี้ ตัวอย่างเช่น แผงไซแนปติกประกอบด้วยโปรตีนหลายชนิดที่ถูกลดลงอย่างมีนัยสำคัญในสมอง AD และ CSF (รูปที่ S5A) ในบรรดาตัวบ่งชี้น้ำไขสันหลังที่ควบคุมไม่ได้เหล่านี้ ได้แก่ NPTX2 และ VGF ของ M1 และ chromogranin B ของ M12 อย่างไรก็ตาม แม้จะมีข้อยกเว้นเหล่านี้ แต่เครื่องหมายซินแนปติกของเราส่วนใหญ่ได้รับการยกระดับในน้ำไขสันหลัง AD โดยรวมแล้ว การวิเคราะห์เหล่านี้สามารถแยกแยะแนวโน้มที่มีนัยสำคัญทางสถิติในระดับสมองและน้ำไขสันหลังในแต่ละแผงทั้งห้าของเรา แนวโน้มเหล่านี้เน้นถึงความสัมพันธ์ที่ซับซ้อนและมักจะแตกต่างกันระหว่างสมองและการแสดงออกของโปรตีน CSF ใน AD
จากนั้นเราใช้การวิเคราะห์การจำลองแบบ MS ความเร็วสูง (การจำลองแบบ CSF 1) เพื่อจำกัดชุดตัวบ่งชี้ทางชีวภาพ 271 ชุดของเราให้แคบลงให้เหลือเป้าหมายที่มีแนวโน้มและทำซ้ำได้มากที่สุด (รูปที่ 5A) CSF สำเนา 1 มีทั้งหมด 96 ตัวอย่างจาก Emory Goizueta ADRC รวมถึงกลุ่มควบคุม, AsymAD และ AD cohort (ตาราง S1A) กรณี AD เหล่านี้มีลักษณะพิเศษคือการลดลงเล็กน้อยของการรับรู้ (ค่าเฉลี่ย MoCA, 20.0 ± 3.8) และการเปลี่ยนแปลงในตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของ AD ที่ยืนยันในน้ำไขสันหลัง (ตาราง S1A) ตรงกันข้ามกับการวิเคราะห์ CSF ที่เราพบ การจำลองแบบนี้ดำเนินการโดยใช้วิธี MS แบบ "นัดเดียว" ที่มีประสิทธิภาพและปริมาณงานสูง (โดยไม่มีการแยกส่วนแบบออฟไลน์) รวมถึงโปรโตคอลการเตรียมตัวอย่างแบบง่าย ซึ่งช่วยลดความจำเป็นในภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่องของแต่ละตัวอย่าง . แทนที่จะใช้ "ช่องทางเสริม" ที่ไม่มีภูมิคุ้มกันเพียงช่องทางเดียวเพื่อขยายสัญญาณของโปรตีนที่มีปริมาณน้อยลง (37) แม้ว่าจะช่วยลดความครอบคลุมของโปรตีโอมทั้งหมด แต่วิธีการฉีดครั้งเดียวนี้จะช่วยลดเวลาของเครื่องลงอย่างมาก และเพิ่มจำนวนตัวอย่างที่ติดฉลาก TMT ที่สามารถวิเคราะห์ได้ (17, 38) โดยรวมแล้ว การวิเคราะห์ระบุเปปไทด์ 6,487 ตัว ซึ่งจับคู่กับโปรตีโอม 1,183 ตัวใน 96 กรณี เช่นเดียวกับการวิเคราะห์ CSF ที่เราพบ เฉพาะโปรตีนเหล่านั้นที่ระบุปริมาณในตัวอย่างอย่างน้อย 50% เท่านั้นที่ถูกรวมไว้ในการคำนวณครั้งต่อไป และข้อมูลถูกถดถอยสำหรับผลกระทบของอายุและเพศ สิ่งนี้นำไปสู่การหาปริมาณสุดท้ายของโปรตีโอม 792 ตัว ซึ่ง 95% ของจำนวนนั้นถูกระบุในชุดข้อมูล CSF ที่พบเช่นกัน
( A ) เป้าหมายโปรตีน CSF ที่เกี่ยวข้องกับสมองได้รับการตรวจสอบในกลุ่ม CSF ที่จำลองแบบครั้งแรกและรวมอยู่ในแผงสุดท้าย (n = 60) (B ถึง E) ระดับไบโอมาร์คเกอร์ของแผง (คะแนน z คอมโพสิต) ที่วัดในกลุ่มการจำลองแบบ CSF สี่กลุ่ม การทดสอบทีคู่หรือการวิเคราะห์ความแปรปรวนกับการแก้ไขหลังของ Tukey ถูกนำมาใช้เพื่อประเมินนัยสำคัญทางสถิติของการเปลี่ยนแปลงในความอุดมสมบูรณ์ในการวิเคราะห์ซ้ำแต่ละครั้ง ซีทีควบคุม
เนื่องจากเรามีความสนใจเป็นพิเศษในการตรวจสอบเป้าหมาย CSF ที่เกี่ยวข้องกับสมอง 271 รายการของเราผ่านการวิเคราะห์ที่ครอบคลุม เราจะจำกัดการตรวจสอบเพิ่มเติมของโปรตีโอมที่จำลองแบบนี้ไว้ที่เครื่องหมายเหล่านี้ ในบรรดาโปรตีน 271 ตัวเหล่านี้ มีการตรวจพบ 100 ตัวในการจำลองแบบ CSF 1 รูปที่ S6A แสดงการแสดงออกที่แตกต่างกันของเครื่องหมายที่ทับซ้อนกัน 100 ตัวเหล่านี้ระหว่างตัวอย่างการควบคุมและการจำลองแบบ AD ฮิสโตนซินแนปติกและเมตาบอไลต์จะเพิ่มขึ้นมากที่สุดใน AD ในขณะที่โปรตีนในหลอดเลือดลดลงมากที่สุดในโรค เครื่องหมายที่ทับซ้อนกัน 100 ตัวส่วนใหญ่ (n = 70) คงทิศทางการเปลี่ยนแปลงเดียวกันในชุดข้อมูลทั้งสอง (รูปที่ S6B) เครื่องหมาย CSF ที่เกี่ยวข้องกับสมองที่ได้รับการตรวจสอบแล้ว 70 รายการ (ตาราง S2H) ส่วนใหญ่สะท้อนถึงแนวโน้มการแสดงออกของพาเนลที่สังเกตไว้ก่อนหน้านี้ นั่นคือการควบคุมที่ลดลงของโปรตีนในหลอดเลือด และการควบคุมที่เพิ่มขึ้นของพาเนลอื่นทั้งหมด โปรตีนที่ผ่านการตรวจสอบแล้วเพียง 10 จาก 70 รายการเท่านั้นที่แสดงการเปลี่ยนแปลงของความอุดมสมบูรณ์ของ AD ซึ่งขัดแย้งกับแนวโน้มของแผงเหล่านี้ เพื่อสร้างแผงที่สะท้อนแนวโน้มโดยรวมของสมองและน้ำไขสันหลังได้ดีที่สุด เราได้แยกโปรตีน 10 ชนิดนี้ออกจากกลุ่มความสนใจที่เราตรวจสอบในที่สุด (รูปที่ 5A) ดังนั้น คณะผู้วิจัยของเราจึงรวมโปรตีนทั้งหมด 60 รายการที่ได้รับการตรวจสอบในกลุ่ม CSF AD อิสระสองกลุ่มโดยใช้การเตรียมตัวอย่างที่แตกต่างกันและการวิเคราะห์แพลตฟอร์ม MS แผนการแสดงออกคะแนน z ของพาเนลสุดท้ายเหล่านี้ในตัวควบคุมสำเนา CSF 1 และกรณี AD ยืนยันแนวโน้มของพาเนลที่สังเกตในกลุ่ม CSF ที่เราพบ (รูปที่ 5B)
ในบรรดาโปรตีน 60 ชนิดนี้มีโมเลกุลที่ทราบกันว่าเกี่ยวข้องกับ AD เช่น Osteopontin (SPP1) ซึ่งเป็นไซโตไคน์ที่ทำให้เกิดการอักเสบซึ่งสัมพันธ์กับ AD ในการศึกษาจำนวนมาก (39-41) และ GAP43 ซึ่งเป็นโปรตีนซินแนปติก ที่เชื่อมโยงอย่างชัดเจนกับการเสื่อมของระบบประสาท (42) โปรตีนที่ได้รับการตรวจสอบอย่างสมบูรณ์ที่สุดคือเครื่องหมายที่เกี่ยวข้องกับโรคทางระบบประสาทอื่นๆ เช่น amyotrophic lateral sclerosis (ALS) ที่เกี่ยวข้องกับ superoxide dismutase 1 (SOD1) และ desaccharase ที่เกี่ยวข้องกับโรคพาร์กินสัน (PARK7) นอกจากนี้เรายังตรวจสอบด้วยว่าเครื่องหมายอื่น ๆ อีกมากมายเช่น SMOC1 และโปรตีนส่งสัญญาณการแนบเมมเบรนที่อุดมด้วยสมอง 1 (BASP1) มีการเชื่อมโยงก่อนหน้ากับการเสื่อมของระบบประสาทอย่าง จำกัด เป็นที่น่าสังเกตว่าเนื่องจากความอุดมสมบูรณ์โดยรวมต่ำในโปรตีโอม CSF จึงเป็นเรื่องยากสำหรับเราที่จะใช้วิธีการตรวจจับนัดเดียวที่มีปริมาณงานสูงเพื่อตรวจจับ MAPT และโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับ AD อื่น ๆ ที่เชื่อถือได้ (เช่น NEFL และ NRGN ) ( 43, 44)
จากนั้นเราตรวจสอบเครื่องหมายแผงลำดับความสำคัญ 60 รายการเหล่านี้ในการวิเคราะห์ซ้ำเพิ่มเติมสามรายการ ใน CSF Copy 2 เราใช้ TMT-MS ตัวเดียวในการวิเคราะห์กลุ่มควบคุมอิสระ 297 กลุ่มและตัวอย่าง AD จาก Emory Goizueta ADRC (17) การจำลองแบบ CSF 3 รวมการวิเคราะห์ข้อมูล TMT-MS ที่มีอยู่ใหม่จากกลุ่มควบคุม 120 รายและผู้ป่วย AD จากโลซาน ประเทศสวิตเซอร์แลนด์ (45) เราตรวจพบมากกว่าสองในสามของเครื่องหมายลำดับความสำคัญ 60 รายการในแต่ละชุดข้อมูล แม้ว่าการศึกษาของสวิสจะใช้แพลตฟอร์ม MS ที่แตกต่างกันและวิธีการวัดปริมาณ TMT (45, 46) แต่เราได้สร้างแนวโน้มแบบกลุ่มของเราอีกครั้งอย่างมากในการวิเคราะห์ซ้ำสองครั้ง (รูปที่ 5, C และ D และตาราง S2, I และ J) เพื่อประเมินความจำเพาะของโรคในกลุ่มของเรา เราใช้ TMT-MS เพื่อวิเคราะห์ชุดข้อมูลการจำลองแบบที่สี่ (การจำลองแบบ CSF 4) ซึ่งรวมถึงไม่เพียงแต่การควบคุม (n = 18) และกรณี AD (n = 17) แต่ยังรวมถึง PD ( n = 14)), ALS (n = 18) และตัวอย่างภาวะสมองเสื่อมส่วนหน้า (FTD) (n = 11) (ตาราง S1A) เราประสบความสำเร็จในการหาปริมาณเกือบสองในสามของโปรตีนแผงในกลุ่มนี้ (38 จาก 60) ผลลัพธ์เหล่านี้เน้นการเปลี่ยนแปลงเฉพาะ AD ในแผงตัวบ่งชี้ทางชีวภาพทั้งห้าแผง (รูปที่ 5E และตาราง S2K) การเพิ่มขึ้นของกลุ่มเมตาบอไลท์แสดงให้เห็นความจำเพาะของ AD ที่แข็งแกร่งที่สุด ตามมาด้วยกลุ่มไมอีลิเนชันและกลุ่มเกลีย ในระดับที่น้อยกว่า FTD ยังแสดงการเพิ่มขึ้นระหว่างแผงเหล่านี้ ซึ่งอาจสะท้อนถึงการเปลี่ยนแปลงเครือข่ายที่อาจเกิดขึ้นที่คล้ายกัน (17) ในทางตรงกันข้าม ALS และ PD แสดงโปรไฟล์ myelination, glial และ metabolome เกือบจะเหมือนกันกับกลุ่มควบคุม โดยรวมแล้ว แม้จะมีความแตกต่างในการเตรียมตัวอย่าง แพลตฟอร์ม MS และวิธีการหาปริมาณ TMT การวิเคราะห์ซ้ำๆ เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าเครื่องหมายแผงลำดับความสำคัญของเรามีการเปลี่ยนแปลงเฉพาะ AD ที่มีความสอดคล้องสูงในตัวอย่าง CSF ที่ไม่ซ้ำกันมากกว่า 500 ตัวอย่าง
การเสื่อมของระบบประสาทของ AD ได้รับการยอมรับอย่างกว้างขวางหลายปีก่อนที่จะเริ่มมีอาการทางปัญญา ดังนั้นจึงมีความจำเป็นเร่งด่วนสำหรับตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของ AsymAD (5, 31) อย่างไรก็ตาม มีหลักฐานมากขึ้นเรื่อยๆ ที่แสดงให้เห็นว่าชีววิทยาของ AsymAD นั้นยังห่างไกลจากความเป็นเนื้อเดียวกัน และปฏิสัมพันธ์ที่ซับซ้อนของความเสี่ยงและความยืดหยุ่นทำให้เกิดความแตกต่างอย่างมากในแต่ละบุคคลในการลุกลามของโรคที่ตามมา (47) แม้ว่าจะใช้เพื่อระบุกรณีของ AsymAD แต่ระดับของตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของ CSF หลัก (Aβ1-42, เทาทั้งหมดและ p-tau) ยังไม่ได้รับการพิสูจน์ว่าสามารถทำนายได้อย่างน่าเชื่อถือว่าใครจะก้าวหน้าไปสู่ภาวะสมองเสื่อม (4, 7) ซึ่งบ่งชี้ได้มากกว่านั้น อาจเป็น จำเป็นต้องรวมเครื่องมือไบโอมาร์คเกอร์แบบองค์รวมโดยอิงจากหลายแง่มุมของสรีรวิทยาของสมอง เพื่อแบ่งกลุ่มความเสี่ยงของประชากรกลุ่มนี้ได้อย่างแม่นยำ ดังนั้นเราจึงวิเคราะห์แผง biomarker ที่ผ่านการตรวจสอบ AD ของเราในประชากร AsymAD ของสำเนา CSF 1 กรณี AsymAD 31 รายเหล่านี้แสดงระดับ biomarker หลักที่ผิดปกติ (Aβ1–42/อัตราส่วน tau ELISA ทั้งหมด, <5.5) และการรับรู้ที่สมบูรณ์ (ค่าเฉลี่ย MoCA, 27.1 ± 2.2) (ตาราง S1A) นอกจากนี้ บุคคลทุกคนที่มีภาวะ AsymAD มีคะแนนภาวะสมองเสื่อมทางคลินิกอยู่ที่ 0 ซึ่งบ่งชี้ว่าไม่มีหลักฐานใดที่แสดงว่าประสิทธิภาพการรับรู้หรือการทำงานในแต่ละวันลดลง
ก่อนอื่นเราวิเคราะห์ระดับของพาเนลที่ได้รับการตรวจสอบแล้วในการจำลอง CSF ทั้งหมด 96 รายการ 1 รวมถึงกลุ่ม AsymAD เราพบว่าแผงหลายแผงในกลุ่ม AsymAD มีการเปลี่ยนแปลงความอุดมสมบูรณ์คล้าย AD อย่างมีนัยสำคัญ แผงหลอดเลือดมีแนวโน้มลดลงใน AsymAD ในขณะที่แผงอื่น ๆ ทั้งหมดแสดงแนวโน้มขาขึ้น (รูปที่ 6A) ดังนั้นพาเนลทั้งหมดจึงแสดงความสัมพันธ์ที่มีนัยสำคัญอย่างมากกับ ELISA Aβ1-42 และระดับเอกภาพทั้งหมด (รูปที่ 6B) ในทางตรงกันข้าม ความสัมพันธ์ระหว่างกลุ่มกับคะแนน MoCA ค่อนข้างต่ำ หนึ่งในการค้นพบที่โดดเด่นกว่าจากการวิเคราะห์เหล่านี้คือความอุดมสมบูรณ์ของแผงที่หลากหลายในกลุ่ม AsymAD ดังที่แสดงในรูปที่ 6A ระดับแผงของกลุ่ม AsymAD มักจะข้ามระดับแผงของกลุ่มควบคุมและกลุ่ม AD ซึ่งแสดงความแปรปรวนค่อนข้างสูง เพื่อสำรวจความแตกต่างของ AsymAD นี้เพิ่มเติม เราได้ใช้การวิเคราะห์ Multi Dimension Scaling (MDS) กับการจำลองแบบ CSF 96 กรณี 1 กรณี การวิเคราะห์ MDS ช่วยให้เห็นภาพความคล้ายคลึงกันระหว่างกรณีต่างๆ โดยอิงตามตัวแปรบางตัวในชุดข้อมูล สำหรับการวิเคราะห์คลัสเตอร์นี้ เราจะใช้เฉพาะพาเนลมาร์กเกอร์ที่ได้รับการตรวจสอบความถูกต้องซึ่งมีการเปลี่ยนแปลงที่มีนัยสำคัญทางสถิติ (P <0.05, AD/การควบคุม) ในการค้นพบ CSF และการจำลองแบบ 1 โปรตีโอม (n = 29) (ตาราง S2L) การวิเคราะห์นี้สร้างการจัดกลุ่มเชิงพื้นที่ที่ชัดเจนระหว่างการควบคุมของเราและกรณี AD (รูปที่ 6C) ในทางตรงกันข้าม กรณี AsymAD บางกรณีจะรวมอยู่ในกลุ่มควบคุมอย่างชัดเจน ในขณะที่กรณีอื่นๆ จะอยู่ในกรณี AD เพื่อสำรวจความแตกต่างของ AsymAD นี้เพิ่มเติม เราใช้แผนที่ MDS ของเราเพื่อกำหนดสองกลุ่มของกรณี AsymAD เหล่านี้ กลุ่มแรกรวมกรณี AsymAD ที่คลัสเตอร์ใกล้กับตัวควบคุมมากขึ้น (n = 19) ในขณะที่กลุ่มที่สองมีลักษณะเฉพาะโดยกรณี AsymAD ที่มีโปรไฟล์เครื่องหมายใกล้กับ AD มากขึ้น (n = 12)
( A ) ระดับการแสดงออก (z -score) ของกลุ่ม biomarker CSF ในตัวอย่างทั้งหมด 96 ตัวอย่างในกลุ่มการจำลองแบบ CSF 1 รวมถึง AsymAD การวิเคราะห์ความแปรปรวนด้วยการแก้ไขหลังของ Tukey ถูกนำมาใช้เพื่อประเมินนัยสำคัญทางสถิติของการเปลี่ยนแปลงความอุดมสมบูรณ์ของแผง ( B ) การวิเคราะห์สหสัมพันธ์ของระดับความอุดมสมบูรณ์ของโปรตีนพาเนล (z -score) กับคะแนน MoCA และระดับเอกภาพทั้งหมดใน ELISA Aβ1-42 และ CSF คัดลอก 1 ตัวอย่าง ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์เพียร์สันกับค่า P ที่เกี่ยวข้องจะปรากฏขึ้น ( C ) MDS ของสำเนา 96 CSF 1 กรณีขึ้นอยู่กับระดับความอุดมสมบูรณ์ของเครื่องหมายพาเนลที่ได้รับการตรวจสอบแล้ว 29 รายการ ซึ่งมีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญทั้งในชุดข้อมูลการค้นพบและสำเนา CSF 1 1 [ P <0.05 AD/การควบคุม (CT)] การวิเคราะห์นี้ใช้เพื่อแบ่งกลุ่ม AsymAD ออกเป็นกลุ่มย่อยควบคุม (n = 19) และ AD (n = 12) ( D ) พล็อตภูเขาไฟแสดงการแสดงออกที่แตกต่างของโปรตีนการจำลองแบบ CSF 1 ทั้งหมดที่มีการเปลี่ยนแปลง log2 เท่า (แกน x) สัมพันธ์กับค่า P ทางสถิติ -log10 ระหว่างกลุ่มย่อย AsymAD สองกลุ่ม ไบโอมาร์คเกอร์แบบแผงมีสี (E) การจำลองแบบ CSF ระดับความอุดมสมบูรณ์ 1 ของตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของกลุ่มการคัดเลือกจะแสดงออกมาแตกต่างกันระหว่างกลุ่มย่อย AsymAD การวิเคราะห์ความแปรปรวนหลังการปรับปรุงของ Tukey ถูกนำมาใช้เพื่อประเมินนัยสำคัญทางสถิติ
เราตรวจสอบการแสดงออกของโปรตีนที่แตกต่างระหว่างการควบคุมเหล่านี้และกรณี AsymAD ที่คล้าย AD (รูปที่ 6D และตาราง S2L) ผลลัพธ์แผนที่ภูเขาไฟแสดงให้เห็นว่าเครื่องหมายบนแผง 14 อันมีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญระหว่างทั้งสองกลุ่ม เครื่องหมายเหล่านี้ส่วนใหญ่เป็นสมาชิกของไซแนปส์และเมตาโบโลม อย่างไรก็ตาม SOD1 และสารตั้งต้น C ของโปรตีนไคเนสที่อุดมด้วยอะลานีน myristoylated (MARCKS) ซึ่งเป็นสมาชิกของกลุ่มภูมิคุ้มกันไมอีลินและ glial ตามลำดับก็อยู่ในกลุ่มนี้เช่นกัน (รูปที่ 6, D และ E) แผงหลอดเลือดยังมีส่วนบ่งชี้สองตัวที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่ม AsymAD ที่คล้าย AD ซึ่งรวมถึงโปรตีนที่มีผลผูกพัน AE 1 (AEBP1) และสมาชิกในครอบครัว C9 ที่สมบูรณ์ ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มควบคุมและกลุ่มย่อย AsymAD ที่คล้าย AD ใน ELISA AB1-42 (P = 0.38) และ p-tau (P = 0.28) แต่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในระดับเอกภาพทั้งหมด (P = 0.0031 ) (รูปที่ S7) มีเครื่องหมายแผงหลายอันที่ระบุว่าการเปลี่ยนแปลงระหว่างกลุ่มย่อย AsymAD สองกลุ่มมีความสำคัญมากกว่าระดับเอกภาพทั้งหมด (เช่น YWHAZ, SOD1 และ MDH1) (รูปที่ 6E) โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าแผงที่ได้รับการตรวจสอบของเราอาจมีตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่สามารถแบ่งประเภทย่อยและการแบ่งชั้นความเสี่ยงที่อาจเกิดขึ้นของผู้ป่วยที่ไม่มีอาการ
มีความจำเป็นเร่งด่วนสำหรับเครื่องมือไบโอมาร์คเกอร์ที่เป็นระบบ เพื่อให้สามารถวัดและกำหนดเป้าหมายพยาธิสรีรวิทยาต่างๆ ที่อยู่เบื้องหลัง AD ได้ดีขึ้น เครื่องมือเหล่านี้คาดว่าจะไม่เพียงแต่เปลี่ยนกรอบการวินิจฉัย AD ของเราเท่านั้น แต่ยังส่งเสริมการนำกลยุทธ์การรักษาเฉพาะผู้ป่วยที่มีประสิทธิผลมาใช้ (1, 2) ด้วยเหตุนี้เราจึงใช้วิธีการโปรตีโอมิกส์แบบครอบคลุมที่เป็นกลางกับสมอง AD และ CSF เพื่อระบุตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของ CSF บนเว็บที่สะท้อนถึงพยาธิสรีรวิทยาทางสมองที่หลากหลาย การวิเคราะห์ของเราสร้างแผงไบโอมาร์คเกอร์ CSF ห้าแผง ซึ่ง (i) สะท้อนถึงไซแนปส์ หลอดเลือด ไมอีลิน ความผิดปกติของระบบภูมิคุ้มกันและเมตาบอลิซึม; (ii) แสดงให้เห็นถึงความสามารถในการทำซ้ำที่แข็งแกร่งบนแพลตฟอร์ม MS ที่แตกต่างกัน (iii) แสดงการเปลี่ยนแปลงเฉพาะโรคที่ก้าวหน้าตลอดช่วงต้นและระยะปลายของ AD โดยรวมแล้ว การค้นพบนี้ถือเป็นก้าวสำคัญในการพัฒนาเครื่องมือไบโอมาร์คเกอร์บนเว็บที่หลากหลายและเชื่อถือได้สำหรับการวิจัย AD และการใช้งานทางคลินิก
ผลลัพธ์ของเราแสดงให้เห็นถึงองค์กรที่ได้รับการอนุรักษ์อย่างสูงของโปรตีนเครือข่ายสมอง AD และสนับสนุนการใช้เป็นจุดยึดสำหรับการพัฒนาไบโอมาร์คเกอร์ตามระบบ การวิเคราะห์ของเราแสดงให้เห็นว่าชุดข้อมูล TMT-MS อิสระสองชุดที่มีสมอง AD และ AsymAD มีโมดูลาร์ที่แข็งแกร่ง การค้นพบนี้ขยายขอบเขตงานก่อนหน้านี้ของเรา ซึ่งแสดงให้เห็นถึงการรักษาโมดูลอันทรงพลังของเนื้อเยื่อสมองมากกว่า 2,000 ชิ้นจากกลุ่มประชากรอิสระหลายกลุ่มในเยื่อหุ้มสมองส่วนหน้า ข้างขม่อม และเยื่อหุ้มสมองขมับ (17) เครือข่ายฉันทามตินี้สะท้อนให้เห็นถึงการเปลี่ยนแปลงที่เกี่ยวข้องกับโรคต่างๆ ที่สังเกตได้ในการวิจัยปัจจุบัน รวมถึงการเพิ่มขึ้นของโมดูลการอักเสบที่อุดมด้วย glial และการลดลงของโมดูลที่อุดมด้วยเซลล์ประสาท เช่นเดียวกับการวิจัยในปัจจุบัน เครือข่ายขนาดใหญ่นี้ยังมีการเปลี่ยนแปลงแบบโมดูลาร์ที่สำคัญใน AsymAD ซึ่งแสดงให้เห็นพยาธิสรีรวิทยาพรีคลินิกที่หลากหลาย (17)
อย่างไรก็ตาม ภายในกรอบการทำงานที่อิงระบบอนุรักษ์นิยมสูงนี้ มีความหลากหลายทางชีวภาพที่มีความละเอียดมากขึ้น โดยเฉพาะอย่างยิ่งในหมู่บุคคลในระยะแรกของ AD แผงตัวชี้วัดทางชีวภาพของเราสามารถพรรณนากลุ่มย่อยสองกลุ่มใน AsymAD ซึ่งแสดงให้เห็นถึงการแสดงออกที่แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญของเครื่องหมาย CSF หลายตัว กลุ่มของเราสามารถเน้นความแตกต่างทางชีวภาพระหว่างกลุ่มย่อยทั้งสองนี้ ซึ่งไม่ชัดเจนในระดับตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของ AD หลัก เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม อัตราส่วนAβ1-42/เทารวมของบุคคล AsymAD เหล่านี้ต่ำผิดปกติ อย่างไรก็ตาม เฉพาะระดับเอกภาพทั้งหมดเท่านั้นที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มย่อย AsymAD สองกลุ่ม ในขณะที่ระดับ Aβ1-42 และ p-tau ยังคงเทียบเคียงได้ค่อนข้างดี เนื่องจาก CSF tau ที่สูงดูเหมือนจะเป็นตัวทำนายอาการทางปัญญาได้ดีกว่าระดับAβ1-42 (7) เราจึงสงสัยว่ากลุ่ม AsymAD ทั้งสองกลุ่มอาจมีความเสี่ยงที่แตกต่างกันของการลุกลามของโรค เนื่องจากขนาดตัวอย่างที่จำกัดของ AsymAD ของเราและการไม่มีข้อมูลตามยาว จึงจำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติมเพื่อให้ได้ข้อสรุปเหล่านี้อย่างมั่นใจ อย่างไรก็ตาม ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าแผง CSF ที่ใช้ระบบสามารถเพิ่มความสามารถของเราในการแบ่งชั้นบุคคลได้อย่างมีประสิทธิภาพในระหว่างระยะที่ไม่มีอาการของโรค
โดยรวมแล้วการค้นพบของเราสนับสนุนบทบาทของการทำงานทางชีววิทยาหลายอย่างในการเกิดโรคของ AD อย่างไรก็ตาม เมแทบอลิซึมของพลังงานที่ไม่เป็นระเบียบกลายเป็นประเด็นสำคัญในแผงการติดฉลากที่ได้รับการตรวจสอบแล้วทั้งห้าแผงของเรา โปรตีนเมตาบอลิซึม เช่น hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) และแลคเตทดีไฮโดรจีเนสเอ (LDHA) เป็นไบโอมาร์คเกอร์ซินแนปติกที่ได้รับการตรวจสอบอย่างแข็งแกร่งที่สุด ซึ่งบ่งชี้ว่าการเพิ่มขึ้นของ AD CSF นั้นเป็นเพศที่ทำซ้ำได้สูง หลอดเลือดและแผงเกลียของเรายังมีเครื่องหมายหลายอย่างที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญสารออกซิเดชั่น การค้นพบนี้สอดคล้องกับบทบาทสำคัญของกระบวนการเผาผลาญในสมองทั้งหมด ไม่เพียงตอบสนองความต้องการพลังงานสูงของเซลล์ประสาทเท่านั้น แต่ยังตอบสนองความต้องการพลังงานสูงของแอสโตรไซต์และเซลล์เกลียอื่นๆ ด้วย (17, 48) ผลลัพธ์ของเราสนับสนุนหลักฐานที่เพิ่มขึ้นว่าการเปลี่ยนแปลงศักยภาพรีดอกซ์และการหยุดชะงักของเส้นทางพลังงานอาจเป็นการเชื่อมโยงหลักระหว่างกระบวนการสำคัญหลายประการที่เกี่ยวข้องกับการเกิดโรคของ AD รวมถึงความผิดปกติของไมโตคอนเดรีย การอักเสบที่ใช้สื่อกลาง glial และความเสียหายของหลอดเลือด (49) นอกจากนี้ biomarkers ของน้ำไขสันหลังเมตาบอลิซึมยังมีโปรตีนที่มีความแตกต่างจำนวนมากระหว่างการควบคุมของเราและกลุ่มย่อย AsymAD ที่มีลักษณะคล้าย AD ซึ่งชี้ให้เห็นว่าการหยุดชะงักของพลังงานและวิถีรีดอกซ์เหล่านี้อาจมีความสำคัญในระยะพรีคลินิกของโรค
แนวโน้มของแผงสมองและน้ำไขสันหลังที่แตกต่างกันที่เราสังเกตเห็นก็มีผลกระทบทางชีวภาพที่น่าสนใจเช่นกัน ไซแนปส์และเมตาโบโลมที่อุดมไปด้วยเซลล์ประสาทแสดงระดับที่ลดลงในสมอง AD และเพิ่มความอุดมสมบูรณ์ในน้ำไขสันหลัง เนื่องจากเซลล์ประสาทอุดมไปด้วยไมโตคอนเดรียที่ผลิตพลังงานที่ไซแนปส์เพื่อให้พลังงานสำหรับสัญญาณพิเศษจำนวนมาก (50) จึงคาดว่าจะมีความคล้ายคลึงกันของโปรไฟล์การแสดงออกของเซลล์ประสาททั้งสองกลุ่มนี้ การสูญเสียเซลล์ประสาทและการหลุดออกมาของเซลล์ที่เสียหายสามารถอธิบายแนวโน้มของสมองและแผง CSF เหล่านี้ในโรคในภายหลังได้ แต่ไม่สามารถอธิบายการเปลี่ยนแปลงแผงแรกที่เราสังเกตได้ (13) คำอธิบายหนึ่งที่เป็นไปได้สำหรับการค้นพบเหล่านี้ในโรคที่ไม่มีอาการในระยะเริ่มแรกคือการตัดแต่งกิ่งซินแนปติกที่ผิดปกติ หลักฐานใหม่ในแบบจำลองเมาส์แสดงให้เห็นว่า phagocytosis synaptic ที่ใช้สื่อกลาง microglia อาจถูกกระตุ้นอย่างผิดปกติใน AD และนำไปสู่การสูญเสียไซแนปส์ในสมองตั้งแต่เนิ่นๆ (51) วัสดุซินแนปติกที่ถูกทิ้งนี้อาจสะสมใน CSF ซึ่งเป็นสาเหตุที่เราสังเกตเห็นการเพิ่มขึ้นของ CSF ในแผงควบคุมของเซลล์ประสาท การตัดแต่งกิ่งซินแนปติกโดยอาศัยภูมิคุ้มกันอาจอธิบายบางส่วนเกี่ยวกับการเพิ่มขึ้นของโปรตีน glial ที่เราสังเกตเห็นในสมองและน้ำไขสันหลังตลอดกระบวนการของโรค นอกเหนือจากการตัดไซแนปติกแล้ว ความผิดปกติโดยรวมในวิถีทางเอกโซไซติกยังอาจนำไปสู่การแสดงออกของเครื่องหมายของเส้นประสาทในสมองและน้ำไขสันหลังที่แตกต่างกัน การศึกษาจำนวนหนึ่งแสดงให้เห็นว่าเนื้อหาของ exosomes ในการเกิดโรคของสมอง AD มีการเปลี่ยนแปลง (52) วิถีนอกเซลล์ยังเกี่ยวข้องกับการแพร่กระจายของAβ (53, 54) เป็นที่น่าสังเกตว่าการปราบปรามการหลั่งของ exosomal อาจลดพยาธิสภาพที่คล้าย AD ในเมาส์จำลองพันธุกรรม AD (55)
ในเวลาเดียวกัน โปรตีนในแผงหลอดเลือดแสดงให้เห็นว่าสมอง AD เพิ่มขึ้นปานกลาง แต่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในน้ำไขสันหลัง ความผิดปกติของอุปสรรคเลือดและสมอง (BBB) ​​​​สามารถอธิบายการค้นพบนี้ได้บางส่วน การศึกษาอิสระในมนุษย์หลังการชันสูตรจำนวนมากได้แสดงให้เห็นถึงการสลาย BBB ใน AD (56, 57) การศึกษาเหล่านี้ยืนยันกิจกรรมที่ผิดปกติต่างๆ รอบๆ ชั้นเซลล์บุผนังหลอดเลือดที่ปิดสนิท รวมถึงการรั่วไหลของเส้นเลือดฝอยในสมอง และการสะสมของโปรตีนในเลือดในหลอดเลือด (57) ข้อมูลนี้สามารถให้คำอธิบายง่ายๆ เกี่ยวกับโปรตีนในหลอดเลือดที่เพิ่มขึ้นในสมอง แต่ไม่สามารถอธิบายการสูญเสียโปรตีนชนิดเดียวกันนี้ในน้ำไขสันหลังได้ครบถ้วน ความเป็นไปได้ประการหนึ่งก็คือระบบประสาทส่วนกลางกำลังแยกโมเลกุลเหล่านี้ออกอย่างแข็งขันเพื่อแก้ปัญหาการอักเสบและความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชั่นที่เพิ่มขึ้น การลดลงของโปรตีน CSF ที่รุนแรงที่สุดในกลุ่มนี้ โดยเฉพาะอย่างยิ่งโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมไลโปโปรตีน มีความเกี่ยวข้องกับการยับยั้งระดับการอักเสบที่เป็นอันตรายและกระบวนการปกป้องระบบประสาทของสายพันธุ์ออกซิเจนที่เกิดปฏิกิริยา นี่เป็นเรื่องจริงสำหรับ Paroxonase 1 (PON1) ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่มีผลผูกพันกับไลโปโปรตีนซึ่งทำหน้าที่ลดระดับความเครียดจากปฏิกิริยาออกซิเดชั่นในการไหลเวียน (58, 59) สารตั้งต้น Alpha-1-microglobulin/bikunin (AMBP) เป็นอีกหนึ่งเครื่องหมายควบคุมที่สำคัญของกลุ่มหลอดเลือด เป็นสารตั้งต้นของ bikunin ซึ่งเป็นตัวขนส่งไขมัน ซึ่งเกี่ยวข้องกับการปราบปรามการอักเสบและการป้องกันทางระบบประสาท (60, 61)
แม้จะมีสมมติฐานที่น่าสนใจมากมาย การไม่สามารถตรวจจับกลไกโรคทางชีวเคมีได้โดยตรงนั้นเป็นข้อ จำกัด ที่รู้จักกันดีของการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์ที่ขับเคลื่อนด้วยการค้นพบ ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติมเพื่อกำหนดกลไกเบื้องหลังแผงตัวชี้วัดทางชีวภาพเหล่านี้อย่างมั่นใจ เพื่อก้าวไปสู่การพัฒนาการวิเคราะห์ทางคลินิกโดยใช้ MS ทิศทางในอนาคตยังกำหนดให้ต้องใช้วิธีการเชิงปริมาณแบบกำหนดเป้าหมายสำหรับการตรวจสอบตัวบ่งชี้ทางชีวภาพขนาดใหญ่ เช่น การตรวจสอบปฏิกิริยาแบบเลือกหรือแบบคู่ขนาน (62) เมื่อเร็ว ๆ นี้เราใช้การติดตามปฏิกิริยาแบบขนาน (63) เพื่อตรวจสอบความถูกต้องของการเปลี่ยนแปลงโปรตีน CSF หลายอย่างที่อธิบายไว้ที่นี่ เป้าหมายแผงที่มีลำดับความสำคัญหลายรายการจะถูกวัดปริมาณด้วยความแม่นยำที่สำคัญ รวมถึง YWHAZ, ALDOA และ SMOC1 ซึ่งจับคู่กับแผงไซแนปส์ เมแทบอลิซึม และการอักเสบของเรา ตามลำดับ (63) การได้มาซึ่งข้อมูลโดยอิสระ (DIA) และกลยุทธ์ที่ใช้ MS อื่นๆ อาจเป็นประโยชน์สำหรับการตรวจสอบเป้าหมายด้วย บัด และคณะ (64) แสดงให้เห็นเมื่อเร็วๆ นี้ว่ามีการทับซ้อนกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของ AD ที่ระบุในชุดข้อมูลการค้นพบ CSF ของเรา และชุดข้อมูล DIA-MS อิสระ ซึ่งประกอบด้วยตัวอย่าง CSF เกือบ 200 ตัวอย่างจากกลุ่มประชากรตามรุ่นในยุโรปที่แตกต่างกันสามกลุ่ม การศึกษาล่าสุดเหล่านี้สนับสนุนศักยภาพของกลุ่มตัวอย่างของเราในการแปลงเป็นการตรวจจับที่ใช้ MS ที่เชื่อถือได้ การตรวจจับแอนติบอดีแบบดั้งเดิมและการตรวจจับโดยใช้แอปทาเมอร์ก็มีความสำคัญต่อการพัฒนาตัวบ่งชี้ทางชีวภาพ AD ที่สำคัญต่อไป เนื่องจากมี CSF ในปริมาณที่น้อย การตรวจจับตัวบ่งชี้ทางชีวภาพเหล่านี้โดยใช้วิธี MS ที่ให้ปริมาณงานสูงจึงทำได้ยากขึ้น NEFL และ NRGN เป็นสองตัวอย่างของตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของ CSF ที่มีความอุดมสมบูรณ์ต่ำ ซึ่งเชื่อมโยงกับแผงในการวิเคราะห์ที่ครอบคลุมของเรา แต่ไม่สามารถตรวจพบได้อย่างน่าเชื่อถือโดยใช้กลยุทธ์ MS เดียวของเรา กลยุทธ์การกำหนดเป้าหมายที่มีพื้นฐานอยู่บนแอนติบอดีหลายชนิด เช่น กฟภ. อาจส่งเสริมการเปลี่ยนแปลงทางคลินิกของเครื่องหมายเหล่านี้
โดยรวมแล้ว การศึกษานี้นำเสนอแนวทางโปรตีโอมิกส์ที่เป็นเอกลักษณ์สำหรับการระบุและการตรวจสอบตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของ CSF AD ตามระบบที่แตกต่างกัน การเพิ่มประสิทธิภาพแผงเครื่องหมายเหล่านี้ในกลุ่ม AD เพิ่มเติมและแพลตฟอร์ม MS อาจพิสูจน์ได้ว่ามีแนวโน้มที่จะเพิ่มการแบ่งชั้นและการรักษาความเสี่ยง AD การศึกษาที่ประเมินระดับตามยาวของแผงข้อมูลเหล่านี้ในช่วงเวลาหนึ่งก็มีความสำคัญเช่นกันในการพิจารณาว่าชุดค่าผสมของเครื่องหมายใดแบ่งชั้นความเสี่ยงของโรคในระยะเริ่มแรกและการเปลี่ยนแปลงความรุนแรงของโรคได้ดีที่สุด
ยกเว้นตัวอย่าง 3 ตัวอย่างที่คัดลอกโดย CSF ตัวอย่าง CSF ทั้งหมดที่ใช้ในการศึกษานี้ถูกรวบรวมภายใต้การอุปถัมภ์ของ Emory ADRC หรือสถาบันวิจัยที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด มีการใช้ตัวอย่าง Emory CSF ทั้งหมดสี่ชุดในการศึกษาโปรตีโอมิกส์เหล่านี้ พบว่ากลุ่ม CSF มีตัวอย่างจากกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี 20 รายและผู้ป่วย AD 20 ราย CSF สำเนา 1 ประกอบด้วยตัวอย่างจากกลุ่มควบคุมที่มีสุขภาพดี 32 ราย บุคคลที่มี AsymAD 31 ราย และบุคคล AD 33 ราย CSF copy 2 มีตัวควบคุม 147 ตัวและตัวอย่าง AD 150 ตัว การจำลองแบบ CSF หลายโรค 4 รุ่นรวมกลุ่มควบคุม 18 ตัว, 17 AD, 19 ALS, 13 PD และ 11 ตัวอย่าง FTD ตามข้อตกลงที่ได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการพิจารณาประจำสถาบันของมหาวิทยาลัย Emory ผู้เข้าร่วมการศึกษาของ Emory ทุกคนได้รับความยินยอมโดยแจ้งให้ทราบ ตามแนวทางปฏิบัติที่ดีที่สุดสำหรับศูนย์โรคอัลไซเมอร์แห่งชาติของสถาบันผู้สูงอายุแห่งชาติประจำปี 2014 (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) น้ำไขสันหลังจะถูกรวบรวมและจัดเก็บโดยการเจาะบริเวณเอว ผู้ป่วยกลุ่มควบคุมและ AsymAD และ AD ได้รับการประเมินการรับรู้ที่เป็นมาตรฐานที่ Emory Cognitive Neurology Clinic หรือ Goizueta ADRC ตัวอย่างน้ำไขสันหลังของพวกเขาได้รับการทดสอบโดย INNO-BIA AlzBio3 Luminex สำหรับ ELISA Aβ1-42, การวิเคราะห์เอกภาพทั้งหมดและ p-tau (65) ค่า ELISA ใช้เพื่อสนับสนุนการจำแนกประเภทการวินิจฉัยของอาสาสมัครตามเกณฑ์การตัดค่าตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของ AD ที่กำหนดไว้ (66, 67) ข้อมูลประชากรและการวินิจฉัยขั้นพื้นฐานสำหรับการวินิจฉัย CSF อื่นๆ (FTD, ALS และ PD) ยังได้มาจาก Emory ADRC หรือสถาบันวิจัยในเครือ ข้อมูลเมตากรณีสรุปสำหรับกรณี Emory CSF เหล่านี้มีอยู่ในตาราง S1A คุณลักษณะของกลุ่มการจำลองแบบ Swiss CSF 3 ได้รับการเผยแพร่ก่อนหน้านี้ (45)
CSF พบตัวอย่างแล้ว เพื่อที่จะเพิ่มความลึกในการค้นพบชุดข้อมูล CSF ของเรา จึงมีการดำเนินการการบริโภคภูมิคุ้มกันของโปรตีนที่มีความอุดมสมบูรณ์สูงก่อนที่จะทำการทริปซิไนเซชัน กล่าวโดยย่อคือ CSF 130 μl จากตัวอย่าง CSF 40 ตัวอย่างและปริมาตรเท่ากัน (130 μl) ของเรซินพร่องโปรตีนที่มีความอุดมสมบูรณ์สูง Select Top14 (Thermo Fisher Scientific, A36372) ถูกวางไว้ในคอลัมน์หมุน (Thermo Fisher Scientific, A89868) ที่ห้อง อุณหภูมิฟักตัว) หลังจากปั่นเป็นเวลา 15 นาที ให้ปั่นแยกตัวอย่างที่ 1000 กรัม เป็นเวลา 2 นาที อุปกรณ์กรองแบบหมุนเหวี่ยงพิเศษ 3K (มิลลิพอร์, UFC500396) ถูกนำมาใช้เพื่อทำให้ตัวอย่างน้ำทิ้งเข้มข้นโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 14,000 กรัมเป็นเวลา 30 นาที เจือปริมาตรตัวอย่างทั้งหมดเป็น 75 ไมโครลิตรด้วยน้ำเกลือบัฟเฟอร์ฟอสเฟต ความเข้มข้นของโปรตีนได้รับการประเมินโดยวิธีกรดไบซินโคนิก (BCA) ตามระเบียบวิธีของผู้ผลิต (Thermo Fisher Scientific) CSF ที่ไม่มีภูมิคุ้มกันบกพร่อง (60 μl) จากตัวอย่างทั้งหมด 40 ตัวอย่างถูกย่อยด้วย lysyl endopeptidase (LysC) และทริปซิน โดยสรุป ตัวอย่างถูกรีดิวซ์และเติมอัลคิลด้วย 1.2 ไมโครลิตร 0.5 โมลาร์ ทริส-2(-คาร์บอกซีเอทิล)-ฟอสฟีน และ 3 ไมโครลิตร 0.8 โมลาร์ คลอโรอะซีตาไมด์ที่ 90°C เป็นเวลา 10 นาที และจากนั้น sonicated ในอ่างน้ำเป็นเวลา 15 นาที ตัวอย่างถูกเจือจางด้วยบัฟเฟอร์ยูเรีย 193 ไมโครลิตร 8 โมลาร์ [8 โมลาร์ยูเรียและ 100 มิลลิโมลาร์ NaHPO4 (pH 8.5)] จนถึงความเข้มข้นสุดท้ายที่ 6 โมลาร์ยูเรีย LysC (4.5 μg; Wako) ใช้สำหรับการย่อยข้ามคืนที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นตัวอย่างถูกเจือจางจนถึง 1 โมลาร์ยูเรียด้วยแอมโมเนียม ไบคาร์บอเนต (ABC) 50 มิลลิโมลาร์ (68) เติมทริปซิน (โพรเมกา) ในปริมาณที่เท่ากัน (4.5 ไมโครกรัม) จากนั้นฟักตัวอย่างเป็นเวลา 12 ชั่วโมง ทำให้สารละลายเปปไทด์ที่ถูกย่อยกลายเป็นกรดจนได้ความเข้มข้นสุดท้ายคือกรดฟอร์มิก (FA) 1% และกรดไตรฟลูออโรอะซิติก (TFA) 0.1% (66) จากนั้นแยกเกลือด้วยคอลัมน์ Sep-Pak C18 (น้ำ) 50 มก. ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น (25) . จากนั้นจึงชะเปปไทด์ใน 50% อะซีโตไนไตรล์ (ACN) 1 มิลลิลิตร เพื่อสร้างมาตรฐานของปริมาณโปรตีนในแต่ละแบตช์ (25) จึงนำส่วนลงตัว 100 ไมโครลิตรจากตัวอย่าง CSF ทั้งหมด 40 ตัวอย่างมารวมกันเพื่อสร้างตัวอย่างแบบผสม จากนั้นจึงแบ่งออกเป็นตัวอย่างมาตรฐานภายในระดับโลก (GIS) (48) ห้าตัวอย่าง ตัวอย่างแต่ละรายการและสารมาตรฐานที่รวมกันทั้งหมดจะถูกทำให้แห้งด้วยสุญญากาศความเร็วสูง (Labconco)
CSF คัดลอกตัวอย่าง Dayon และเพื่อนร่วมงานได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ว่าภูมิคุ้มกันพร่องและการย่อยของตัวอย่าง CSF copy 3 (45, 46) ตัวอย่างการทำซ้ำที่เหลือไม่ได้ถูกทำให้ภูมิคุ้มกันบกพร่องแยกกัน ย่อยตัวอย่างที่ไม่ถูกกำจัดเหล่านี้ในทริปซินตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (17) สำหรับการวิเคราะห์ซ้ำแต่ละครั้ง ส่วนย่อย 120 ไมโครลิตรของเปปไทด์ที่ถูกชะจากแต่ละตัวอย่างถูกรวมเข้าด้วยกันและแบ่งออกเป็นส่วนลงตัวที่มีปริมาตรเท่ากันเพื่อใช้เป็นมาตรฐานภายในสากลที่มีป้ายกำกับ TMT (48) ตัวอย่างแต่ละรายการและสารมาตรฐานที่รวมกันทั้งหมดจะถูกทำให้แห้งด้วยสุญญากาศความเร็วสูง (Labconco) เพื่อเพิ่มสัญญาณของโปรตีน CSF ที่มีความอุดมสมบูรณ์ต่ำ ด้วยการรวม 125 ไมโครลิตรจากแต่ละตัวอย่าง ตัวอย่างที่ "ปรับปรุงแล้ว" จึงถูกเตรียมไว้สำหรับการวิเคราะห์ซ้ำแต่ละครั้ง [กล่าวคือ ตัวอย่างทางชีวภาพที่เลียนแบบตัวอย่างการวิจัย แต่ปริมาณที่มีอยู่คือ ใหญ่กว่ามาก (37, 69)] รวมกันเป็นตัวอย่างน้ำไขสันหลังแบบผสม (17) จากนั้นตัวอย่างที่ผสมแล้วจะถูกกำจัดภูมิคุ้มกันออกโดยใช้เรซินกำจัดโปรตีนที่อุดมไปด้วย Select Top14 จำนวน 12 มล. (Thermo Fisher Scientific, A36372) ย่อยตามที่อธิบายไว้ข้างต้น และรวมอยู่ในการติดฉลาก TMT หลายรายการในภายหลัง