สิ่งมีชีวิตที่อุณหภูมิสูงสังเกตได้ในหลอดทดลองด้วยอนุภาคนาโนทองคำที่ได้รับความร้อนด้วยเลเซอร์

ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.com เวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดต (หรือปิดใช้งานโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจะเรนเดอร์ไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
Thermophiles เป็นจุลินทรีย์ที่เจริญเติบโตได้ที่อุณหภูมิสูง การศึกษาสิ่งเหล่านี้สามารถให้ข้อมูลอันมีค่าเกี่ยวกับการปรับตัวของชีวิตให้เข้ากับสภาวะสุดขั้วได้ อย่างไรก็ตาม กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงแบบธรรมดาจะบรรลุสภาวะอุณหภูมิสูงได้ยาก มีการเสนอวิธีแก้ปัญหาแบบทำเองที่บ้านโดยใช้การทำความร้อนด้วยไฟฟ้าแบบต้านทานในท้องถิ่น แต่ไม่มีวิธีแก้ปัญหาเชิงพาณิชย์แบบง่าย ๆ ในบทความนี้ เราแนะนำแนวคิดของการให้ความร้อนด้วยเลเซอร์ด้วยกล้องจุลทรรศน์เหนือขอบเขตการมองเห็นของกล้องจุลทรรศน์ เพื่อให้อุณหภูมิสูงสำหรับการศึกษาเกี่ยวกับความร้อน ในขณะเดียวกันก็รักษาสภาพแวดล้อมของผู้ใช้ให้อบอุ่น การทำความร้อนด้วยกล้องจุลทรรศน์ที่ความเข้มของเลเซอร์ในระดับปานกลางสามารถทำได้โดยใช้ซับสเตรตที่เคลือบด้วยอนุภาคนาโนทองคำเป็นตัวดูดซับแสงที่เข้ากันได้ทางชีวภาพและมีประสิทธิภาพ มีการหารือถึงผลกระทบที่เป็นไปได้ของการพาของเหลวด้วยกล้องจุลทรรศน์ การกักเก็บเซลล์ และการเคลื่อนที่ของเทอร์โมโฟเรติกแบบแรงเหวี่ยง วิธีการนี้แสดงให้เห็นในสองสายพันธุ์: (i) Geobacillus stearothermophilus ซึ่งเป็นแบคทีเรียที่ชอบความร้อนซึ่งแพร่พันธุ์ได้ที่อุณหภูมิประมาณ 65°C ซึ่งเราสังเกตเห็นว่างอก เติบโต และว่ายน้ำภายใต้การให้ความร้อนด้วยกล้องจุลทรรศน์; (ii) Thiobacillus sp. ซึ่งเป็นอาร์เคียที่มีความร้อนสูงอย่างเหมาะสมที่สุด ที่อุณหภูมิ 80°C งานนี้ปูทางให้สังเกตจุลินทรีย์ที่ชอบความร้อนได้ง่ายและปลอดภัยโดยใช้เครื่องมือทางกล้องจุลทรรศน์ที่ทันสมัยและราคาไม่แพง
เป็นเวลากว่าพันล้านปีที่สิ่งมีชีวิตบนโลกมีวิวัฒนาการเพื่อปรับตัวให้เข้ากับสภาพแวดล้อมที่หลากหลาย ซึ่งบางครั้งถือว่าสุดขั้วจากมุมมองของมนุษย์ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง จุลินทรีย์ที่ชอบความร้อน (แบคทีเรีย อาร์เคีย เชื้อรา) ที่เรียกว่า เทอร์โมฟิล เจริญเติบโตได้ในช่วงอุณหภูมิตั้งแต่ 45°C ถึง 122°C1, 2, 3, 4 เทอร์โมฟิลิกอาศัยอยู่ในระบบนิเวศต่างๆ เช่น ช่องระบายความร้อนใต้ทะเลลึก น้ำพุร้อน หรือพื้นที่ภูเขาไฟ งานวิจัยของพวกเขาสร้างความสนใจอย่างมากในช่วงสองสามทศวรรษที่ผ่านมาด้วยเหตุผลอย่างน้อยสองประการ ประการแรก เราสามารถเรียนรู้จากสิ่งเหล่านี้ได้ เช่น เทอร์โมไฟล์ 5, 6, เอนไซม์ 7, 8 และเมมเบรน 9 มีความเสถียรที่อุณหภูมิสูงเช่นนี้ได้อย่างไร หรือวิธีที่เทอร์โมฟิลสามารถทนต่อรังสีในระดับที่รุนแรงได้อย่างไร ประการที่สอง เป็นพื้นฐานสำหรับการใช้งานด้านเทคโนโลยีชีวภาพที่สำคัญหลายอย่าง1,11,12 เช่น การผลิตเชื้อเพลิง13,14,15,16 การสังเคราะห์ทางเคมี (ไดไฮโดร แอลกอฮอล์ มีเทน กรดอะมิโน ฯลฯ)17 การทำเหมืองแร่ชีวภาพ18 และตัวเร่งปฏิกิริยาทางชีวภาพที่ทนความร้อนได้7 ,11, 13. โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสที่รู้จักกันดีในปัจจุบัน (PCR) เกี่ยวข้องกับเอนไซม์ (Taq polymerase) ที่แยกได้จากแบคทีเรียที่ชอบความร้อน Thermus Aquaticus ซึ่งเป็นหนึ่งในเทอร์โมฟิลชนิดแรกๆ ที่ถูกค้นพบ
อย่างไรก็ตาม การศึกษาเกี่ยวกับความร้อนไม่ใช่เรื่องง่ายและไม่สามารถทำแบบด้นสดในห้องปฏิบัติการทางชีววิทยาใดๆ ได้ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ไม่สามารถสังเกตเทอร์โมฟิลที่มีชีวิตได้ในหลอดทดลองด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงมาตรฐานใดๆ แม้แต่ในห้องให้ความร้อนที่มีจำหน่ายทั่วไป ซึ่งปกติจะมีอุณหภูมิต่ำถึง 40°C ก็ตาม นับตั้งแต่ทศวรรษ 1990 มีกลุ่มวิจัยเพียงไม่กี่กลุ่มที่อุทิศตนให้กับการนำระบบกล้องจุลทรรศน์อุณหภูมิสูง (HTM) มาใช้ ในปี 1994 Glukh และคณะ ห้องทำความร้อน/ทำความเย็นได้รับการออกแบบโดยใช้เซลล์ Peltier ที่ควบคุมอุณหภูมิของเส้นเลือดฝอยรูปสี่เหลี่ยมผืนผ้าที่ปิดเพื่อรักษาภาวะไร้ออกซิเจน 20 อุปกรณ์นี้สามารถให้ความร้อนได้สูงถึง 100 °C ในอัตรา 2 °C/s ช่วยให้ผู้เขียนสามารถศึกษาการเคลื่อนที่ของแบคทีเรียที่มีอุณหภูมิสูงเกิน Thermotoga maritima21 ได้ ในปี 1999 ฮอร์น และคณะ อุปกรณ์ที่คล้ายกันมากได้รับการพัฒนา โดยยังคงใช้เส้นเลือดฝอยที่ให้ความร้อนซึ่งเหมาะสำหรับการใช้กล้องจุลทรรศน์เชิงพาณิชย์เพื่อศึกษาการแบ่ง/การเชื่อมต่อของเซลล์ หลังจากไม่ได้ใช้งานเป็นเวลานาน การค้นหา HTM ที่มีประสิทธิภาพก็กลับมาอีกครั้งในปี 2012 โดยเฉพาะอย่างยิ่งที่เกี่ยวข้องกับชุดเอกสารของกลุ่ม Wirth ที่ใช้อุปกรณ์ที่ Horn และคณะคิดค้นขึ้น สิบห้าปีที่แล้ว มีการศึกษาการเคลื่อนที่ของอาร์เคียจำนวนมาก รวมถึงไฮเปอร์เทอร์โมไฟล์ ด้วยการศึกษาที่อุณหภูมิสูงถึง 100°C โดยใช้เส้นเลือดฝอยที่ให้ความร้อน พวกเขายังได้ปรับเปลี่ยนกล้องจุลทรรศน์แบบเดิมเพื่อให้ได้รับความร้อนเร็วขึ้น (หลายนาทีแทนที่จะเป็น 35 นาทีเพื่อให้ได้อุณหภูมิที่ตั้งไว้) และบรรลุการไล่ระดับอุณหภูมิเชิงเส้นมากกว่า 2 ซม. ทั่วทั้งตัวกลาง อุปกรณ์ปรับรูปร่างการไล่ระดับอุณหภูมิ (TGFD) นี้ใช้เพื่อศึกษาการเคลื่อนที่ของเทอร์โมไฟล์จำนวนมากภายในการไล่ระดับอุณหภูมิที่ระยะที่เกี่ยวข้องทางชีวภาพ 24, 25
การให้ความร้อนแก่เส้นเลือดฝอยแบบปิดไม่ใช่วิธีเดียวที่จะสังเกตเทอร์โมฟิลที่มีชีวิตได้ ในปี 2012 Kuwabara และคณะ ใช้ห้อง Pyrex แบบใช้แล้วทิ้งแบบโฮมเมดปิดผนึกด้วยกาวทนความร้อน (Super X2; Cemedine, ญี่ปุ่น) ตัวอย่างถูกวางบนแผ่นทำความร้อนโปร่งใสที่มีจำหน่ายทั่วไป (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japan) ซึ่งสามารถทำความร้อนได้สูงถึง 110°C แต่เดิมทีไม่ได้มีไว้สำหรับการถ่ายภาพทางชีวภาพ ผู้เขียนสังเกตการแบ่งตัวที่มีประสิทธิภาพของแบคทีเรียเทอร์โมฟิลิกแบบไม่ใช้ออกซิเจน (เทอร์โมซิโฟ โกลบิฟอร์แมน เพิ่มเวลาเป็นสองเท่า 24 นาที) ที่อุณหภูมิ 65°C ในปี 2020 Pulshen และคณะ การทำความร้อนอย่างมีประสิทธิภาพของจานโลหะเชิงพาณิชย์ (AttofluorTM, Thermofisher) ได้รับการสาธิตโดยใช้องค์ประกอบความร้อนแบบโฮมเมดสองชิ้น: ฝาปิดและแท่น (โครงร่างที่ได้แรงบันดาลใจจากเครื่องจักร PCR) การเชื่อมโยงนี้ส่งผลให้อุณหภูมิของของเหลวสม่ำเสมอ และป้องกันการระเหยและการควบแน่นที่ด้านล่างของฝา การใช้โอริงช่วยหลีกเลี่ยงการแลกเปลี่ยนก๊าซกับสิ่งแวดล้อม HTM นี้เรียกว่าซัลโลสโคป ใช้ในการถ่ายภาพซัลโฟโลบัส แอซิโดคัลดาเรียสที่อุณหภูมิ 75°C27
ข้อจำกัดที่เป็นที่ยอมรับของระบบทั้งหมดเหล่านี้คือการจำกัดการใช้วัตถุประสงค์ทางอากาศ การแช่น้ำมันใดๆ ที่ไม่เหมาะสมกับอุณหภูมิสูงเช่นนี้ และสำหรับการถ่ายภาพผ่านตัวอย่างโปร่งใสที่มีความหนา >1 มม. ข้อจำกัดที่เป็นที่ยอมรับของระบบทั้งหมดเหล่านี้คือการจำกัดการใช้วัตถุประสงค์ทางอากาศ การแช่น้ำมันใดๆ ที่ไม่เหมาะสมกับอุณหภูมิสูงเช่นนี้ และสำหรับการถ่ายภาพผ่านตัวอย่างโปร่งใสที่มีความหนา >1 มม. ощепризнаннымнедостататомвсехтихистемооограничениенаисповованиевозеничекъролив нноеогржениевмаслонеоходилоятакойвысокойтемпезрырырыиезроoun ข้อบกพร่องที่ได้รับการยอมรับของระบบทั้งหมดเหล่านี้คือข้อจำกัดในการใช้วัตถุประสงค์ทางอากาศ เนื่องจากการแช่น้ำมันใดๆ ไม่เหมาะสำหรับอุณหภูมิสูงเช่นนี้และสำหรับการแสดงภาพผ่านตัวอย่างโปร่งใสที่มีความหนา > 1 มม.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合这样的高温和通过> 1 毫米厚的透明样品成กรอง. ข้อจำกัดที่เป็นที่ยอมรับของระบบทั้งหมดนี้คือข้อจำกัดของการใช้กระจกที่มีฟองอากาศ เนื่องจากการแช่น้ำมันไม่เหมาะสำหรับการถ่ายภาพตัวอย่างโปร่งใสที่มีความหนา >1 มม. ที่อุณหภูมิสูงเช่นนี้ Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных объективов, любое иммерсионно е погружение в масло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозрачные образцы толщиной >1 мм. ข้อเสียเปรียบที่เป็นที่ยอมรับของระบบทั้งหมดเหล่านี้คือการใช้เลนส์ลมอย่างจำกัด การแช่น้ำมันใดๆ ไม่เหมาะสมกับอุณหภูมิสูงเช่นนี้และการมองเห็นผ่านตัวอย่างโปร่งใสที่มีความหนา >1 มม.เมื่อเร็วๆ นี้ Charles-Orzag และคณะได้ยกเลิกข้อจำกัดนี้ เมื่อวันที่ 28 กันยายน ที่ผ่านมา ผู้พัฒนาอุปกรณ์ที่ไม่ให้ความร้อนรอบๆ ระบบที่สนใจอีกต่อไป แต่อยู่ภายในกระจกครอบที่หุ้มด้วยชั้นโปร่งใสบางๆ ของตัวต้านทานที่ทำจาก ITO (อินเดียม-ดีบุกออกไซด์) ฝาสามารถทำความร้อนได้ถึง 75 °C โดยส่งกระแสไฟฟ้าผ่านชั้นโปร่งใส อย่างไรก็ตามผู้เขียนจะต้องให้ความร้อนเลนส์ถึงวัตถุด้วย แต่ไม่เกิน 65 °C เพื่อไม่ให้เกิดความเสียหาย
ผลงานเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการพัฒนากล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงอุณหภูมิสูงที่มีประสิทธิภาพยังไม่ได้รับการยอมรับอย่างกว้างขวาง มักต้องใช้อุปกรณ์ทำเอง และมักจะสำเร็จได้ด้วยความละเอียดเชิงพื้นที่ ซึ่งเป็นข้อเสียอย่างร้ายแรงเนื่องจากจุลินทรีย์ที่ชอบความร้อนมีขนาดไม่ใหญ่ไปกว่าสองสามตัว ไมโครมิเตอร์ ปริมาณความร้อนที่ลดลงเป็นกุญแจสำคัญในการแก้ปัญหาสามประการโดยธรรมชาติของ HTM: ความละเอียดเชิงพื้นที่ต่ำ ความเฉื่อยทางความร้อนสูงเมื่อระบบร้อนขึ้น และความร้อนที่เป็นอันตรายขององค์ประกอบโดยรอบ (น้ำมันแช่ เลนส์ใกล้วัตถุ… หรือมือของผู้ใช้) ที่อุณหภูมิสูงจัด -
ในบทความนี้ เราแนะนำ HTM สำหรับการสังเกตเทอร์โมฟิลซึ่งไม่ได้อาศัยการให้ความร้อนแบบต้านทาน แต่เรากลับให้ความร้อนแบบเฉพาะจุดภายในขอบเขตการมองเห็นของกล้องจุลทรรศน์ที่จำกัดโดยการฉายรังสีเลเซอร์ของสารตั้งต้นที่ดูดซับแสง การกระจายตัวของอุณหภูมิถูกมองเห็นได้โดยใช้กล้องจุลทรรศน์เฟสเชิงปริมาณ (QPM) ประสิทธิผลของวิธีนี้แสดงให้เห็นโดย Geobacillus stearothermophilus ซึ่งเป็นแบคทีเรียเทอร์โมฟิลิกที่เคลื่อนที่ได้ซึ่งแพร่พันธุ์ได้ที่อุณหภูมิประมาณ 65°C และมีเวลาเพิ่มขึ้นเป็นสองเท่าที่สั้น (ประมาณ 20 นาที) และ Sulfolobus shibatae ซึ่งเป็นแบคทีเรียที่มีอุณหภูมิสูงซึ่งเติบโตได้อย่างเหมาะสมที่ 80°C (อาร์เคีย) เพื่อแสดงให้เห็น อัตราการจำลองแบบปกติและการว่ายน้ำถูกสังเกตตามฟังก์ชันของอุณหภูมิ เลเซอร์ HTM (LA-HTM) นี้ไม่ถูกจำกัดด้วยความหนาของแผ่นปิดหรือโดยธรรมชาติของวัตถุประสงค์ (การแช่อากาศหรือน้ำมัน) ทำให้สามารถใช้เลนส์ที่มีความละเอียดสูงใดๆ ในตลาดได้ นอกจากนี้ยังไม่ได้รับผลกระทบจากการให้ความร้อนช้าเนื่องจากความเฉื่อยทางความร้อน (ได้รับความร้อนทันทีในระดับมิลลิวินาที) และใช้เฉพาะส่วนประกอบที่มีจำหน่ายในท้องตลาดเท่านั้น ข้อกังวลด้านความปลอดภัยใหม่เพียงอย่างเดียวเกี่ยวข้องกับการมีลำแสงเลเซอร์กำลังสูง (โดยทั่วไปสูงถึง 100 mW) ภายในอุปกรณ์และอาจผ่านดวงตา ซึ่งต้องใช้แว่นตาป้องกัน
หลักการของ LA-HTM คือการใช้เลเซอร์เพื่อให้ความร้อนแก่ตัวอย่างภายในขอบเขตการมองเห็นของกล้องจุลทรรศน์ (รูปที่ 1a) เมื่อต้องการทำเช่นนี้ ตัวอย่างจะต้องดูดซับแสงได้ หากต้องการใช้กำลังเลเซอร์ที่เหมาะสม (น้อยกว่า 100 mW) เราไม่ได้พึ่งพาการดูดกลืนแสงจากตัวกลางของเหลว แต่เพิ่มการดูดกลืนแสงของตัวอย่างโดยการเคลือบพื้นผิวด้วยอนุภาคนาโนทองคำ (รูปที่ 1c) การทำความร้อนอนุภาคนาโนทองคำด้วยแสงมีความสำคัญพื้นฐานในด้านพลาสโมนิกความร้อน โดยคาดว่าจะนำไปใช้ในชีวการแพทย์ นาโนเคมี หรือการเก็บเกี่ยวแสงแดด ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา เราได้ใช้ LA-HTM นี้ในการศึกษาหลายชิ้นที่เกี่ยวข้องกับการใช้งานพลาสมาความร้อนในฟิสิกส์ เคมี และชีววิทยา ปัญหาหลักของวิธีนี้คือการแสดงโปรไฟล์อุณหภูมิสุดท้าย เนื่องจากอุณหภูมิที่เพิ่มขึ้นนั้นจำกัดอยู่ที่บริเวณระดับจุลภาคภายในตัวอย่าง เราได้แสดงให้เห็นว่าการทำแผนที่อุณหภูมิสามารถทำได้ด้วยอินเทอร์เฟอโรมิเตอร์แรงเฉือนตามขวางความยาวคลื่นสี่คลื่น ซึ่งเป็นวิธีการที่เรียบง่าย มีความละเอียดสูง และละเอียดอ่อนมากของกล้องจุลทรรศน์เฟสเชิงปริมาณ โดยอาศัยการใช้เกรตติงการเลี้ยวเบนแบบสองมิติ (หรือที่เรียกว่าครอสเกรตติง) 33,34,35,36. ความน่าเชื่อถือของเทคนิคกล้องจุลทรรศน์ความร้อนนี้ ซึ่งใช้กล้องจุลทรรศน์แบบ crossed grating wavefront (CGM) ได้รับการพิสูจน์แล้วในเอกสารหลายสิบฉบับที่ตีพิมพ์ในช่วงทศวรรษที่ผ่านมา
แผนงานการติดตั้งกล้องจุลทรรศน์การให้ความร้อน การสร้างรูปร่าง และอุณหภูมิด้วยเลเซอร์แบบขนาน b รูปทรงของตัวอย่างประกอบด้วยห้อง AttofluorTM ที่มีแผ่นปิดที่เคลือบด้วยอนุภาคนาโนทองคำ c ดูตัวอย่างอย่างใกล้ชิด (ไม่ใช่ตามขนาด) d แสดงถึงโปรไฟล์ลำแสงเลเซอร์ที่สม่ำเสมอและ (e) การจำลองการกระจายอุณหภูมิตามมาบนระนาบตัวอย่างของอนุภาคนาโนทองคำ f เป็นโปรไฟล์ลำแสงเลเซอร์รูปวงแหวนที่เหมาะสำหรับการสร้างอุณหภูมิที่สม่ำเสมอดังที่แสดงในการจำลองการกระจายอุณหภูมิผลลัพธ์ที่แสดงใน (g) สเกลบาร์: 30 µm
โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เมื่อเร็ว ๆ นี้ เราประสบความสำเร็จในการทำความร้อนเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมด้วย LA-HTM และ CGM และติดตามการตอบสนองการเปลี่ยนแปลงความร้อนของเซลล์ในช่วง 37-42°C ซึ่งแสดงให้เห็นถึงการประยุกต์ใช้เทคนิคนี้กับการถ่ายภาพเซลล์ที่มีชีวิตเดี่ยว อย่างไรก็ตาม การใช้ LA-HTM ในการศึกษาจุลินทรีย์ที่อุณหภูมิสูงนั้นไม่ได้คลุมเครือ เนื่องจากต้องใช้ความระมัดระวังมากกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ประการแรก การให้ความร้อนแก่ด้านล่างของตัวกลางหลายสิบองศา (แทนที่จะเป็น 2-3 องศา) ไปจนถึงการไล่ระดับอุณหภูมิแนวตั้งที่รุนแรง สามารถสร้างการพาความร้อนของของไหล 44 ซึ่งหากไม่ยึดติดกับซับสเตรตอย่างแน่นหนา อาจทำให้เกิดการเคลื่อนไหวและการผสมของแบคทีเรียที่ไม่พึงประสงค์ได้ การพาความร้อนนี้สามารถกำจัดได้โดยการลดความหนาของชั้นของเหลว เพื่อจุดประสงค์นี้ ในการทดลองทั้งหมดที่นำเสนอด้านล่าง สารแขวนลอยของแบคทีเรียถูกวางระหว่างแผ่นปิดสองแผ่นที่มีความหนาประมาณ 15 µm วางอยู่ภายในถ้วยโลหะ (AttofluorTM, Thermofisher, รูปที่ 1b,c) โดยหลักการแล้ว สามารถหลีกเลี่ยงการพาความร้อนได้หากความหนาของของเหลวน้อยกว่าขนาดลำแสงของเลเซอร์ทำความร้อน ประการที่สอง การทำงานในรูปทรงเรขาคณิตที่จำกัดอาจทำให้สิ่งมีชีวิตที่มีออกซิเจนหายใจไม่ออก (ดูรูปที่ S2) ปัญหานี้สามารถหลีกเลี่ยงได้โดยใช้วัสดุพิมพ์ที่สามารถซึมผ่านออกซิเจนได้ (หรือก๊าซสำคัญอื่นๆ) โดยทิ้งฟองอากาศที่ติดอยู่ภายในแผ่นปิด หรือโดยการเจาะรูที่แผ่นปิดด้านบน (ดูรูปที่ S1) 45 ในการศึกษานี้ เราเลือกวิธีแก้ปัญหาหลัง (รูปที่ 1b และ S1) สุดท้ายนี้ การให้ความร้อนด้วยเลเซอร์ไม่ได้ให้การกระจายอุณหภูมิที่สม่ำเสมอ แม้ที่ความเข้มเท่ากันของลำแสงเลเซอร์ (รูปที่ 1d) การกระจายของอุณหภูมิไม่สม่ำเสมอ แต่ค่อนข้างคล้ายกับการกระจายแบบเกาส์เซียนเนื่องจากการแพร่กระจายความร้อน (รูปที่ 1e) เมื่อเป้าหมายคือการกำหนดอุณหภูมิที่แม่นยำในขอบเขตการมองเห็นสำหรับการศึกษาระบบทางชีววิทยา โปรไฟล์ที่ไม่สม่ำเสมอนั้นไม่เหมาะและยังสามารถนำไปสู่การเคลื่อนที่ของแบคทีเรียด้วยความร้อนได้หากพวกมันไม่เกาะติดกับสารตั้งต้น (ดูรูปที่ S3, S4)39 ด้วยเหตุนี้ เราจึงใช้ตัวปรับแสงเชิงพื้นที่ (SLM) เพื่อสร้างลำแสงเลเซอร์อินฟราเรดตามรูปร่างของวงแหวน (รูปที่ 1f) ในระนาบของตัวอย่าง เพื่อให้ได้การกระจายอุณหภูมิที่สม่ำเสมออย่างสมบูรณ์แบบภายในพื้นที่ทางเรขาคณิตที่กำหนด แม้จะมีการแพร่กระจายความร้อน (รูปที่ 1d) 39 , 42, 46 ให้วางแผ่นปิดด้านบนไว้บนจานโลหะ (รูปที่ 1b) เพื่อหลีกเลี่ยงการระเหยของตัวกลาง และสังเกตเป็นเวลาอย่างน้อยสองสามวัน เนื่องจากใบปิดด้านบนนี้ไม่ได้ปิดผนึก จึงสามารถเพิ่มสื่อเพิ่มเติมได้อย่างง่ายดายเมื่อใดก็ได้หากจำเป็น
เพื่อแสดงให้เห็นว่า LA-HTM ทำงานอย่างไรและแสดงให้เห็นถึงความสามารถในการนำไปประยุกต์ใช้ในการวิจัยเกี่ยวกับความร้อน เราได้ศึกษาแบคทีเรียแอโรบิก Geobacillus stearothermophilus ซึ่งมีอุณหภูมิการเติบโตที่เหมาะสมประมาณ 60-65°C แบคทีเรียยังมีแฟลเจลลาและความสามารถในการว่ายน้ำ ซึ่งเป็นอีกตัวบ่งชี้หนึ่งของกิจกรรมของเซลล์ตามปกติ
ตัวอย่าง (รูปที่ 1b) ถูกบ่มล่วงหน้าที่ 60°C เป็นเวลาหนึ่งชั่วโมง และจากนั้นนำไปใส่ในที่ยึดตัวอย่าง LA-HTM การฟักตัวล่วงหน้านี้เป็นทางเลือก แต่ก็ยังมีประโยชน์ด้วยเหตุผลสองประการ ประการแรก เมื่อเปิดเลเซอร์ จะทำให้เซลล์เติบโตและแบ่งตัวทันที (ดูภาพยนตร์ M1 ในวัสดุเสริม) หากไม่มีการฟักตัวล่วงหน้า โดยทั่วไปการเจริญเติบโตของแบคทีเรียจะล่าช้าประมาณ 40 นาทีในแต่ละครั้งที่มีการให้ความร้อนกับพื้นที่รับชมใหม่บนตัวอย่าง ประการที่สอง การฟักตัวล่วงหน้า 1 ชั่วโมงส่งเสริมการยึดเกาะของแบคทีเรียกับแผ่นปิด ป้องกันไม่ให้เซลล์หลุดออกไปจากการมองเห็นเนื่องจากความร้อนเมื่อเปิดเลเซอร์ (ดูฟิล์ม M2 ในวัสดุเสริม) เทอร์โมโฟเรซิสคือการเคลื่อนที่ของอนุภาคหรือโมเลกุลไปตามระดับอุณหภูมิ ซึ่งปกติจากร้อนไปเย็น และแบคทีเรียก็ไม่มีข้อยกเว้น43,47 ผลกระทบที่ไม่พึงประสงค์นี้จะถูกกำจัดออกไปในพื้นที่ที่กำหนดโดยใช้ SLM เพื่อกำหนดรูปร่างลำแสงเลเซอร์และทำให้เกิดการกระจายอุณหภูมิที่ราบเรียบ
บนรูป รูปที่ 2 แสดงการกระจายของอุณหภูมิที่วัดโดย CGM ที่ได้จากการฉายรังสีบนพื้นผิวแก้วที่เคลือบด้วยอนุภาคนาโนทองคำด้วยลำแสงเลเซอร์รูปวงแหวน (รูปที่ 1f) สังเกตการกระจายของอุณหภูมิแบบราบเรียบทั่วทั้งพื้นที่ที่ลำแสงเลเซอร์ปกคลุม โซนนี้ตั้งไว้ที่ 65°C ซึ่งเป็นอุณหภูมิการเจริญเติบโตที่เหมาะสมที่สุด นอกภูมิภาคนี้ เส้นโค้งอุณหภูมิจะลดลงไปที่ \(1/r\) โดยธรรมชาติ (โดยที่ \(r\) คือพิกัดแนวรัศมี)
แผนที่อุณหภูมิของการวัด CGM ที่ได้จากการใช้ลำแสงเลเซอร์รูปวงแหวนเพื่อฉายรังสีชั้นอนุภาคนาโนทองคำเพื่อให้ได้โปรไฟล์อุณหภูมิที่ราบเรียบเหนือพื้นที่วงกลม b ไอโซเทอมของแผนที่อุณหภูมิ (a) รูปร่างของลำแสงเลเซอร์จะแสดงด้วยวงกลมประสีเทา การทดลองซ้ำสองครั้ง (ดูวัสดุเสริม รูปที่ S4)
ความมีชีวิตของเซลล์แบคทีเรียถูกติดตามเป็นเวลาหลายชั่วโมงโดยใช้ LA-HTM บนรูป 3 แสดงช่วงเวลาสำหรับสี่ภาพที่ถ่ายจากภาพยนตร์ความยาว 3 ชั่วโมง 20 นาที (ภาพยนตร์ M3, ข้อมูลเพิ่มเติม) สังเกตพบว่าแบคทีเรียมีการแพร่กระจายอย่างแข็งขันภายในพื้นที่วงกลมที่กำหนดโดยเลเซอร์ ซึ่งมีอุณหภูมิที่เหมาะสมที่สุด โดยเข้าใกล้ 65°C ในทางตรงกันข้าม การเติบโตของเซลล์ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่ออุณหภูมิลดลงต่ำกว่า 50°C เป็นเวลา 10 วินาที
ภาพความลึกเชิงแสงของแบคทีเรีย G. stearothermophilus เติบโตหลังจากการให้ความร้อนด้วยเลเซอร์ในเวลาที่ต่างกัน (a) t = 0 นาที (b) 1 ชั่วโมง 10 นาที (c) 2 ชั่วโมง 20 นาที (d) 3 ชั่วโมง 20 นาที จาก 200 แยกจากฟิล์มหนึ่งนาที (ฟิล์ม M3 ที่ให้ไว้ในข้อมูลเสริม) ซ้อนทับบนแผนที่อุณหภูมิที่สอดคล้องกัน เลเซอร์จะเปิดขึ้น ณ เวลา \(t=0\) เพิ่มไอโซเทอร์มให้กับภาพความเข้มแล้ว
เพื่อหาปริมาณการเติบโตของเซลล์และการพึ่งพาอุณหภูมิ เราได้วัดการเพิ่มขึ้นของมวลชีวภาพของโคโลนีต่าง ๆ ของแบคทีเรียที่แยกได้เริ่มแรกในมุมมองของ Movie M3 (รูปที่ 4) แบคทีเรียต้นกำเนิดที่เลือกที่จุดเริ่มต้นของการก่อตัวหน่วยการขึ้นรูปมินิโคโลนี (mCFU) ถูกแสดงไว้ในรูปที่ S6 การตรวจวัดมวลแห้งดำเนินการด้วยกล้อง CGM 48 ซึ่งใช้ในการจัดทำแผนผังการกระจายตัวของอุณหภูมิ ความสามารถของ CGM ในการวัดน้ำหนักและอุณหภูมิแห้งคือจุดแข็งของ LA-HTM ตามที่คาดไว้ อุณหภูมิสูงทำให้แบคทีเรียเติบโตเร็วขึ้น (รูปที่ 4a) ดังที่แสดงในพล็อตกึ่งบันทึกในรูปที่ 4b การเติบโตที่อุณหภูมิทั้งหมดจะเป็นไปตามการเติบโตแบบเอ็กซ์โปเนนเชียล โดยที่ข้อมูลใช้ฟังก์ชันเอ็กซ์โปเนนเชียล \(m={m} _ {0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\) โดยที่ \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – เวลาในการสร้าง (หรือเวลาสองเท่า), \( g =1/ \tau\) – อัตราการเติบโต (จำนวนดิวิชั่นต่อหน่วยเวลา ) บนรูป 4c แสดงอัตราการเติบโตและเวลาในการสร้างตามลำดับโดยพิจารณาจากอุณหภูมิ mCFU ที่เติบโตอย่างรวดเร็วมีลักษณะเฉพาะโดยการอิ่มตัวของการเติบโตหลังจากสองชั่วโมง ซึ่งเป็นพฤติกรรมที่คาดหวังเนื่องจากความหนาแน่นของแบคทีเรียสูง (คล้ายกับเฟสคงที่ในการเพาะเลี้ยงของเหลวแบบดั้งเดิม) รูปร่างทั่วไป \(g\left(T\right)\) (รูปที่ 4c) สอดคล้องกับเส้นโค้งสองเฟสที่คาดหวังสำหรับ G. stearothermophilus ด้วยอัตราการเติบโตที่เหมาะสมที่สุดประมาณ 60-65°C จับคู่ข้อมูลโดยใช้โมเดลคาร์ดินัล (รูปที่ S5)49 โดยที่ \(\left({{G__{0}{;\;T}__{{\min }};{T__{{opt} } ;{T__{{\max}}\right)\) = (0.70 ± 0.2; 40 ± 4; 65 ± 1.6; 67 ± 3) °C ซึ่งตกลงได้ดีกับค่าอื่นๆ ที่อ้างถึงในวรรณกรรม49 แม้ว่าพารามิเตอร์ที่ขึ้นกับอุณหภูมิจะทำซ้ำได้ แต่อัตราการเติบโตสูงสุดของ \({G__{0}\) อาจแตกต่างกันไปในการทดลองหนึ่งไปยังอีกการทดลองหนึ่ง (ดูรูปที่ S7-S9 และภาพยนตร์ M4) ตรงกันข้ามกับพารามิเตอร์การปรับอุณหภูมิซึ่งควรเป็นแบบสากล อัตราการเติบโตสูงสุดขึ้นอยู่กับคุณสมบัติของตัวกลาง (ความพร้อมใช้ของสารอาหาร ความเข้มข้นของออกซิเจน) ภายในเรขาคณิตของกล้องจุลทรรศน์ที่สังเกตได้
การเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ที่อุณหภูมิต่างๆ mCFU: หน่วยการขึ้นรูปอาณานิคมขนาดเล็ก ข้อมูลที่ได้จากวิดีโอของแบคทีเรียตัวเดียวที่เติบโตในการไล่ระดับอุณหภูมิ (ภาพยนตร์ M3) b เช่นเดียวกับ (a) สเกลกึ่งลอการิทึม c อัตราการเติบโต\(\tau\) และเวลาการสร้าง\(g\) คำนวณจากการถดถอยเชิงเส้น (b) แถบข้อผิดพลาดแนวนอน: ช่วงอุณหภูมิที่ mCFU ขยายไปสู่ขอบเขตการมองเห็นระหว่างการเจริญเติบโต แถบข้อผิดพลาดแนวตั้ง: ข้อผิดพลาดมาตรฐานการถดถอยเชิงเส้น
นอกเหนือจากการเจริญเติบโตตามปกติแล้ว บางครั้งแบคทีเรียบางตัวยังลอยเข้ามาให้เห็นในระหว่างการให้ความร้อนด้วยเลเซอร์ ซึ่งเป็นพฤติกรรมที่คาดหวังสำหรับแบคทีเรียที่มีแฟลเจลลา ข้อมูลเพิ่มเติมในภาพยนตร์เรื่อง M5 แสดงให้เห็นกิจกรรมว่ายน้ำดังกล่าว ในการทดลองนี้ มีการใช้รังสีเลเซอร์สม่ำเสมอเพื่อสร้างการไล่ระดับอุณหภูมิ ดังแสดงในรูปที่ 1d, e และ S3 รูปที่ 5 แสดงลำดับภาพสองลำดับที่เลือกจากภาพยนตร์ M5 ซึ่งแสดงว่าแบคทีเรียตัวหนึ่งแสดงการเคลื่อนไหวตามทิศทาง ในขณะที่แบคทีเรียอื่นๆ ทั้งหมดยังคงไม่เคลื่อนไหว
กรอบเวลาสองกรอบ (a) และ (b) แสดงการว่ายน้ำของแบคทีเรียสองตัวที่แตกต่างกันซึ่งมีเครื่องหมายวงกลมประ ภาพถูกดึงมาจากภาพยนตร์ M5 (จัดให้เป็นวัสดุเสริม)
ในกรณีของ G. stearothermophilus การเคลื่อนไหวของแบคทีเรีย (รูปที่ 5) จะเริ่มขึ้นไม่กี่วินาทีหลังจากเปิดลำแสงเลเซอร์ การสังเกตนี้เน้นการตอบสนองชั่วคราวของจุลินทรีย์ที่ชอบความร้อนต่อการเพิ่มขึ้นของอุณหภูมิ ดังที่โมรา และคณะ สังเกตไว้แล้ว 24 . หัวข้อเรื่องการเคลื่อนที่ของแบคทีเรียและแม้แต่เทอร์โมแท็กซี่สามารถศึกษาเพิ่มเติมได้โดยใช้ LA-HTM
ไม่ควรสับสนระหว่างการว่ายน้ำของจุลินทรีย์กับการเคลื่อนไหวทางกายภาพประเภทอื่น ได้แก่ (i) การเคลื่อนไหวแบบบราวเนียนซึ่งดูเหมือนจะเป็นการเคลื่อนไหวที่วุ่นวายโดยไม่มีทิศทางที่แน่นอน (ii) การพาความร้อน 50 และเทอร์โมโฟเรซิส 43 ประกอบด้วยการเคลื่อนที่แบบดริฟท์สม่ำเสมอตามอุณหภูมิ การไล่ระดับสี
G. stearothermophilus เป็นที่รู้จักจากความสามารถในการผลิตสปอร์ที่มีความทนทานสูง (การสร้างสปอร์) เมื่อสัมผัสกับสภาพแวดล้อมที่เลวร้ายเพื่อเป็นการป้องกัน เมื่อสภาพแวดล้อมเอื้ออำนวยอีกครั้ง สปอร์จะงอก สร้างเซลล์ที่มีชีวิต และกลับมาเติบโตอีกครั้ง แม้ว่ากระบวนการสร้างสปอร์/การงอกนี้เป็นที่ทราบกันดี แต่ก็ไม่เคยมีการสังเกตพบแบบเรียลไทม์ เมื่อใช้ LA-HTM เรารายงานการสังเกตเหตุการณ์การงอกครั้งแรกใน G. stearothermophilus ที่นี่
บนรูป 6a แสดงภาพไทม์แลปส์ของความลึกเชิงแสง (OT) ที่ได้รับโดยใช้ชุด CGM ของสปอร์ 13 ตัว สำหรับเวลารวบรวมทั้งหมด (15 ชั่วโมง 6 นาที \(t=0\) – จุดเริ่มต้นของการให้ความร้อนด้วยเลเซอร์) สปอร์ 4 จาก 13 ตัวงอกที่จุดเวลาต่อเนื่องกัน \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' และ \(11\) h \(30\)' แม้ว่าเหตุการณ์เหล่านี้จะแสดงเพียงเหตุการณ์เดียวในรูปที่ 6 แต่เหตุการณ์การงอก 4 เหตุการณ์สามารถสังเกตได้ในภาพยนตร์ M6 ในวัสดุเสริม สิ่งที่น่าสนใจคือ การงอกดูเหมือนจะเกิดขึ้นแบบสุ่ม สปอร์ไม่ใช่ทุกตัวจะงอกและไม่งอกในเวลาเดียวกัน แม้ว่าสภาพแวดล้อมจะเปลี่ยนแปลงไปเหมือนกันก็ตาม
ไทม์แลปส์ประกอบด้วยภาพ OT 8 ภาพ (การแช่น้ำมัน, วัตถุประสงค์ 60x, 1.25 NA) และ (b) วิวัฒนาการชีวมวลของมวลรวม G. stearothermophilus c (b) วาดบนสเกลกึ่งบันทึกเพื่อเน้นความเป็นเชิงเส้นของอัตราการเติบโต (เส้นประ)
บนรูป 6b,c แสดงชีวมวลของประชากรเซลล์ในขอบเขตการมองเห็นเป็นฟังก์ชันของเวลาตลอดระยะเวลาของการรวบรวมข้อมูล การสลายตัวอย่างรวดเร็วของมวลแห้งที่สังเกตได้ที่ \(t=5\)h ในรูป 6b, c เนื่องจากการออกจากเซลล์บางเซลล์จากมุมมอง อัตราการเติบโตของเหตุการณ์ทั้งสี่นี้คือ \(0.77\pm 0.1\) h-1 ค่านี้จะสูงกว่าอัตราการเติบโตที่เกี่ยวข้องกับรูปที่ 3 3 และ 4 โดยที่เซลล์จะเติบโตตามปกติ สาเหตุของอัตราการเติบโตที่เพิ่มขึ้นของ G. stearothermophilus จากสปอร์นั้นไม่ชัดเจน แต่การวัดเหล่านี้เน้นถึงความสนใจของ LA-HTM และทำงานในระดับเซลล์เดียว (หรือที่ระดับ mCFU เดียว) เพื่อเรียนรู้เพิ่มเติมเกี่ยวกับพลวัตของชีวิตของเซลล์ .
เพื่อแสดงให้เห็นถึงความเก่งกาจของ LA-HTM และประสิทธิภาพของมันที่อุณหภูมิสูง เราได้ตรวจสอบการเจริญเติบโตของ Sulfolobus shibatae ซึ่งเป็นอาร์เคียที่มีกรดในเลือดสูงที่มีอุณหภูมิการเจริญเติบโตที่เหมาะสมที่ 80°C51 เมื่อเปรียบเทียบกับ G. stearothermophilus แล้ว อาร์เคียเหล่านี้ก็มีสัณฐานวิทยาที่แตกต่างกันมาก โดยมีลักษณะคล้ายทรงกลมขนาด 1 ไมครอน (cocci) แทนที่จะเป็นแท่งยาว (bacilli)
รูปที่ 7a ประกอบด้วยภาพความลึกเชิงแสงตามลำดับของ S. shibatae mCFU ที่ได้รับโดยใช้ CGM (ดูภาพยนตร์สารคดี M7 ในวัสดุเสริม) mCFU นี้เติบโตที่ประมาณ 73°C ต่ำกว่าอุณหภูมิที่เหมาะสมที่ 80°C แต่อยู่ภายในช่วงอุณหภูมิสำหรับการเติบโตแบบแอคทีฟ เราสังเกตเห็นเหตุการณ์ฟิชชันหลายครั้งที่ทำให้ mCFU ดูเหมือนไมโครเกรปของอาร์เคียหลังจากผ่านไปไม่กี่ชั่วโมง จากภาพ OT เหล่านี้ ชีวมวล mCFU ถูกวัดเมื่อเวลาผ่านไปและแสดงไว้ในรูปที่ 7b สิ่งที่น่าสนใจคือ S. shibatae mCFU แสดงการเติบโตเชิงเส้นมากกว่าการเติบโตแบบเอ็กซ์โปเนนเชียลที่เห็นได้จาก G. stearothermophilus mCFU มีการถกเถียงกันมานาน 52 เกี่ยวกับธรรมชาติของอัตราการเติบโตของเซลล์: ในขณะที่การศึกษาบางชิ้นรายงานอัตราการเติบโตของจุลินทรีย์ที่เป็นสัดส่วนกับขนาดของพวกมัน (การเติบโตแบบเอ็กซ์โปเนนเชียล) แต่บางการศึกษาก็แสดงอัตราคงที่ (การเติบโตเชิงเส้นหรือบิลิเนียร์) ตามที่อธิบายโดย Tzur และคณะ 53 การแยกแยะความแตกต่างระหว่างการเติบโตแบบเอ็กซ์โพเนนเชียลและ (bi) เชิงเส้นต้องใช้ความแม่นยำ <6% ในการวัดมวลชีวมวล ซึ่งอยู่นอกเหนือการเข้าถึงสำหรับเทคนิค QPM ส่วนใหญ่ แม้จะเกี่ยวข้องกับอินเตอร์เฟอโรเมทก็ตาม ตามที่อธิบายโดย Tzur และคณะ 53 การแยกแยะความแตกต่างระหว่างการเติบโตแบบเอ็กซ์โพเนนเชียลและ (bi) เชิงเส้นต้องใช้ความแม่นยำ <6% ในการวัดมวลชีวมวล ซึ่งอยู่นอกเหนือการเข้าถึงสำหรับเทคนิค QPM ส่วนใหญ่ แม้จะเกี่ยวข้องกับอินเตอร์เฟอโรเมทก็ตาม Как объяснили цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста точности <6% в измерениях биомассы, что недостижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. ตามที่อธิบายโดย Zur และคณะ 53 การแยกแยะความแตกต่างระหว่างการเติบโตแบบเอ็กซ์โปเนนเชียลและ (bi) เชิงเส้นต้องใช้ความแม่นยำ <6% ในการวัดมวลชีวมวล ซึ่งไม่สามารถทำได้สำหรับวิธี QPM ส่วนใหญ่ แม้จะใช้อินเทอร์เฟอโรเมทก็ตามตามที่อธิบายโดย Zur และคณะ ในเวอร์ชัน 53 การแยกความแตกต่างระหว่างการเติบโตแบบเอ็กซ์โพเนนเชียลและ (bi) เชิงเส้นต้องใช้ความแม่นยำน้อยกว่า 6% ในการวัดมวลชีวมวล ซึ่งวิธี QPM ส่วนใหญ่ไม่สามารถบรรลุได้ แม้ว่าจะใช้อินเทอร์เฟอโรเมทก็ตาม CGM ได้รับความแม่นยำนี้ด้วยความแม่นยำระดับ sub-pg ในการตรวจวัดชีวมวล36,48
ไทม์แลปส์ประกอบด้วยภาพ OT 6 ภาพ (การแช่น้ำมัน, 60x, วัตถุประสงค์ NA 1.25) และ (b) วิวัฒนาการของมวลชีวมวล micro-CFU ที่วัดด้วย CGM ดูภาพยนตร์ M7 สำหรับข้อมูลเพิ่มเติม
การเติบโตเชิงเส้นตรงอย่างสมบูรณ์ของ S. shibatae นั้นเป็นสิ่งที่ไม่คาดคิดและยังไม่มีการรายงาน อย่างไรก็ตาม คาดว่าจะมีการเติบโตแบบทวีคูณ อย่างน้อยก็เพราะเมื่อเวลาผ่านไป ต้องมีการแบ่งเซลล์ 2, 4, 8, 16 … หลายเซลล์เกิดขึ้น เราตั้งสมมติฐานว่าการเติบโตเชิงเส้นอาจเกิดจากการยับยั้งเซลล์เนื่องจากการอัดตัวของเซลล์หนาแน่น เช่นเดียวกับการเติบโตของเซลล์ช้าลงและในที่สุดก็เข้าสู่สถานะอยู่เฉยๆ เมื่อความหนาแน่นของเซลล์สูงเกินไป
เราสรุปโดยอภิปรายประเด็นที่น่าสนใจ 5 ประการต่อไปนี้ตามลำดับ: การลดปริมาตรความร้อน การลดความเฉื่อยทางความร้อน ความสนใจในอนุภาคนาโนทองคำ ความสนใจในกล้องจุลทรรศน์เฟสเชิงปริมาณ และช่วงอุณหภูมิที่เป็นไปได้ซึ่งสามารถใช้ LA-HTM ได้
เมื่อเปรียบเทียบกับการให้ความร้อนแบบต้านทาน การให้ความร้อนด้วยเลเซอร์ที่ใช้ในการพัฒนา HTM มีข้อดีหลายประการ ซึ่งเราแสดงให้เห็นในการศึกษานี้ โดยเฉพาะอย่างยิ่งในตัวกลางที่เป็นของเหลวในมุมมองของกล้องจุลทรรศน์ ปริมาตรความร้อนจะถูกเก็บไว้ภายในไม่กี่ (10 ไมโครเมตร) 3 ปริมาตร ด้วยวิธีนี้ เฉพาะจุลินทรีย์ที่สังเกตได้เท่านั้นที่ทำงานอยู่ ในขณะที่แบคทีเรียอื่นๆ อยู่เฉยๆ และสามารถใช้เพื่อศึกษาตัวอย่างเพิ่มเติมได้ โดยไม่จำเป็นต้องเปลี่ยนตัวอย่างทุกครั้งที่ต้องตรวจสอบอุณหภูมิใหม่ นอกจากนี้ การทำความร้อนด้วยกล้องจุลทรรศน์ยังช่วยให้สามารถตรวจสอบช่วงอุณหภูมิที่หลากหลายได้โดยตรง รูปที่ 4c ได้มาจากภาพยนตร์ความยาว 3 ชั่วโมง (ภาพยนตร์ M3) ซึ่งโดยปกติจะต้องมีการเตรียมและตรวจสอบตัวอย่างหลายตัวอย่าง – หนึ่งตัวอย่างสำหรับแต่ละตัวอย่างที่กำลังศึกษาอยู่ y คืออุณหภูมิที่แสดงจำนวนวันในการทดลอง การลดปริมาตรความร้อนยังช่วยรักษาส่วนประกอบทางแสงโดยรอบของกล้องจุลทรรศน์ โดยเฉพาะเลนส์ใกล้วัตถุ ไว้ที่อุณหภูมิห้อง ซึ่งเป็นปัญหาสำคัญที่ชุมชนเผชิญจนถึงตอนนี้ LA-HTM สามารถใช้ได้กับเลนส์ทุกชนิด รวมถึงเลนส์แช่น้ำมัน และจะคงอยู่ที่อุณหภูมิห้อง แม้จะมีอุณหภูมิที่สูงมากในขอบเขตการมองเห็นก็ตาม ข้อจำกัดหลักของวิธีการให้ความร้อนด้วยเลเซอร์ที่เรารายงานในการศึกษานี้คือ เซลล์ที่ไม่เกาะติดหรือลอยอยู่อาจอยู่ไกลจากขอบเขตการมองเห็นและยากต่อการศึกษา วิธีแก้ปัญหาเบื้องต้นคือใช้เลนส์ที่มีกำลังขยายต่ำเพื่อให้ได้อุณหภูมิที่เพิ่มขึ้นมากกว่าสองสามร้อยไมครอน ข้อควรระวังนี้มาพร้อมกับความละเอียดเชิงพื้นที่ที่ลดลง แต่หากเป้าหมายคือเพื่อศึกษาการเคลื่อนที่ของจุลินทรีย์ ก็ไม่จำเป็นต้องมีความละเอียดเชิงพื้นที่สูง
สเกลเวลาสำหรับการทำความร้อน (และความเย็น) ระบบ \({{{{\rm{\tau }}}}}}}`{{{\mbox{D}}}}\) ขึ้นอยู่กับขนาดของมัน ตามกฎหมาย \({{{({\rm{\tau }}}}}}`{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\) โดยที่ \ (L\ ) คือขนาดลักษณะเฉพาะของแหล่งความร้อน (เส้นผ่านศูนย์กลางของลำแสงเลเซอร์ในการศึกษาของเราคือ \(L\ ประมาณ 100\) μm), \(D\) คือการแพร่กระจายความร้อนของสภาพแวดล้อม (ค่าเฉลี่ยใน อัตราการแพร่กระจายของเคส แก้ว และน้ำ\(D\ ประมาณ 2\พับ {10}^{-7}\) m2/s) ดังนั้นในการศึกษานี้ การตอบสนองของเวลาในลำดับ 50 ms คือ เสมือนทันที การเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิสามารถคาดหวังได้ การสร้างอุณหภูมิที่เพิ่มขึ้นทันทีนี้ไม่เพียงแต่ทำให้ระยะเวลาของการทดลองสั้นลง แต่ยังช่วยให้กำหนดเวลาได้อย่างแม่นยำ \(t=0\) สำหรับการศึกษาผลกระทบของอุณหภูมิแบบไดนามิก
วิธีการที่เราเสนอนี้ใช้ได้กับซับสเตรตที่ดูดซับแสงทุกชนิด (เช่น ตัวอย่างเชิงพาณิชย์ที่มีการเคลือบ ITO) อย่างไรก็ตาม อนุภาคนาโนทองคำสามารถให้การดูดกลืนรังสีสูงในอินฟราเรดและการดูดกลืนแสงต่ำในช่วงที่มองเห็นได้ ซึ่งลักษณะหลังนี้เป็นที่สนใจสำหรับการสังเกตด้วยแสงอย่างมีประสิทธิภาพในช่วงที่มองเห็นได้ โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อใช้สารเรืองแสง นอกจากนี้ ทองคำยังเข้ากันได้ทางชีวภาพ ไม่เฉื่อยทางเคมี ความหนาแน่นของแสงสามารถปรับได้ตั้งแต่ 530 นาโนเมตรไปจนถึงอินฟราเรดใกล้ และการเตรียมตัวอย่างทำได้ง่ายและประหยัด29
กล้องจุลทรรศน์แบบตะแกรงหน้าคลื่นตามขวาง (CGM) ไม่เพียงแต่ช่วยให้สามารถจัดทำแผนที่อุณหภูมิที่ระดับไมโครสเกลเท่านั้น แต่ยังรวมถึงการตรวจสอบชีวมวลด้วย ทำให้มีประโยชน์อย่างยิ่ง (หากไม่จำเป็น) เมื่อใช้ร่วมกับ LA-HTM ในช่วงทศวรรษที่ผ่านมา เทคนิคกล้องจุลทรรศน์อุณหภูมิอื่นๆ ได้รับการพัฒนา โดยเฉพาะในด้านการถ่ายภาพชีวภาพ และส่วนใหญ่จำเป็นต้องใช้หัววัดเรืองแสงที่ไวต่ออุณหภูมิ54,55 อย่างไรก็ตาม วิธีการเหล่านี้ถูกวิพากษ์วิจารณ์และรายงานบางฉบับได้ตรวจวัดการเปลี่ยนแปลงของอุณหภูมิที่ไม่สมจริงภายในเซลล์ อาจเนื่องมาจากข้อเท็จจริงที่ว่าการเรืองแสงขึ้นอยู่กับปัจจัยหลายอย่างนอกเหนือจากอุณหภูมิ นอกจากนี้ หัววัดฟลูออเรสเซนต์ส่วนใหญ่ยังไม่เสถียรที่อุณหภูมิสูง ดังนั้น QPM และโดยเฉพาะอย่างยิ่ง CGM จึงเป็นเทคนิคการใช้กล้องจุลทรรศน์อุณหภูมิในอุดมคติสำหรับการศึกษาชีวิตที่อุณหภูมิสูงโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง
การศึกษาเชื้อ S. shibatae ซึ่งมีชีวิตอยู่ได้อย่างเหมาะสมที่อุณหภูมิ 80°C แสดงให้เห็นว่า LA-HTM สามารถนำไปใช้เพื่อศึกษาภาวะเทอร์โมฟิลสูงเกินได้ ไม่ใช่แค่เทอร์โมไฟล์ธรรมดาเท่านั้น โดยหลักการแล้ว ไม่มีการจำกัดช่วงอุณหภูมิที่สามารถเข้าถึงได้โดยใช้ LA-HTM และแม้แต่อุณหภูมิที่สูงกว่า 100°C ก็สามารถเข้าถึงได้ที่ความดันบรรยากาศโดยไม่ต้องเดือด ดังที่แสดงให้เห็นโดยกลุ่ม 38 คนของเราในการใช้งานเคมีความร้อนใต้บรรยากาศที่บรรยากาศ ความดัน A เลเซอร์ใช้ในการทำความร้อนอนุภาคนาโนทองคำ 40 ในลักษณะเดียวกัน ดังนั้น LA-HTM จึงมีศักยภาพที่จะใช้ในการสังเกตภาวะอุณหภูมิเกินร้อนที่ไม่เคยมีมาก่อนด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงความละเอียดสูงมาตรฐานภายใต้สภาวะมาตรฐาน (เช่น ภายใต้ความเครียดจากสิ่งแวดล้อม)
การทดลองทั้งหมดดำเนินการโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบโฮมเมด รวมถึงการส่องสว่างของ Köhler (พร้อม LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), ตัวยึดชิ้นงานที่มีการเคลื่อนที่ xy ด้วยตนเอง, วัตถุประสงค์ (Olympus, 60x, 0.7 NA, อากาศ, LUCPlanFLN60X หรือ 60x, 1.25 NA, น้ำมัน , UPLFLN60XOI), กล้อง CGM (ตะแกรงข้าม QLSI, ระยะพิทช์ 39 µm, 0.87 มม. จากเซ็นเซอร์กล้อง Andor Zyla) เพื่อให้การถ่ายภาพความเข้มและการถ่ายภาพหน้าคลื่น และกล้อง sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, โหมด 16 บิต จาก Hamamatsu) เพื่อบันทึก ข้อมูลแสดงในรูปที่ 5 (การว่ายน้ำของแบคทีเรีย) ตัวแยกลำแสงไดโครอิกคือขอบ BrightLine 749 นาโนเมตร (Semrock, FF749-SDi01) ฟิลเตอร์ที่ด้านหน้ากล้องคือฟิลเตอร์ชอร์ตพาส ​​694 (FF02-694/SP-25, Semrock) เลเซอร์แซฟไฟร์ไทเทเนียม (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, ช่องเลเซอร์สึนามิที่สูบแล้ว, Spectra-Physics ในรูปที่ 2-5, แทนที่ด้วยเลเซอร์ Millenia, Spectraphysics 10 W, ช่องเลเซอร์ Mira ที่สูบแล้ว, Coherent สำหรับรูปที่ 2 -5) 6 และ 7) ถูกตั้งค่าเป็นความยาวคลื่น \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm ซึ่งสอดคล้องกับสเปกตรัมเรโซแนนซ์พลาสมอนของอนุภาคนาโนทองคำ ตัวปรับแสงเชิงพื้นที่ (1920 × 1152 พิกเซล) ถูกซื้อจาก Meadowlark Optics คำนวณโฮโลแกรมโดยใช้อัลกอริทึม Gerchberg-Saxton ตามที่อธิบายไว้ในลิงก์ 39
Cross grating wavefront Microscopy (CGM) เป็นเทคนิคการใช้กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสงโดยอาศัยการรวมตะแกรงเลี้ยวเบนแบบสองมิติ (หรือที่เรียกว่าตะแกรงกากบาท) ที่ระยะห่างหนึ่งมิลลิเมตรจากเซ็นเซอร์ของกล้องทั่วไป ตัวอย่างที่พบบ่อยที่สุดของ CGM ที่เราใช้ในการศึกษานี้เรียกว่าอินเตอร์เฟอโรมิเตอร์แบบกะระยะตามขวางความยาวคลื่นสี่คลื่น (QLSI) โดยที่ตะแกรงกากบาทประกอบด้วยรูปแบบกระดานหมากรุกความเข้ม/เฟสที่แนะนำและจดสิทธิบัตรโดย Primot และคณะ ในปี 200034 เส้นตะแกรงแนวตั้งและแนวนอนสร้างเงาเหมือนตารางบนเซ็นเซอร์ ซึ่งสามารถประมวลผลการบิดเบือนเชิงตัวเลขแบบเรียลไทม์เพื่อให้ได้ความผิดเพี้ยนของคลื่นแสง (หรือโปรไฟล์เฟสที่เทียบเท่า) ของแสงที่ตกกระทบ เมื่อใช้กับกล้องจุลทรรศน์ กล้อง CGM สามารถแสดงความแตกต่างของเส้นทางแสงของวัตถุที่ถ่ายภาพ หรือที่เรียกว่าความลึกของแสง (OT) โดยมีความไวในลำดับนาโนเมตร36 ในการวัด CGM ใดๆ เพื่อกำจัดข้อบกพร่องใดๆ ในส่วนประกอบหรือลำแสงออพติคอล จะต้องถ่ายและลบรูปภาพ OT อ้างอิงหลักออกจากรูปภาพใดๆ ที่ตามมา
กล้องจุลทรรศน์อุณหภูมิดำเนินการโดยใช้กล้อง CGM ตามที่อธิบายไว้ในข้อมูลอ้างอิง 32. กล่าวโดยย่อ การทำความร้อนของเหลวจะเปลี่ยนดัชนีการหักเหของแสง ทำให้เกิดเอฟเฟกต์เลนส์ความร้อนที่บิดเบือนลำแสงที่ตกกระทบ ความบิดเบี้ยวของหน้าคลื่นนี้วัดโดย CGM และประมวลผลโดยใช้อัลกอริธึมการแยกส่วนเพื่อให้ได้การกระจายอุณหภูมิสามมิติในตัวกลางของเหลว หากอนุภาคนาโนทองคำมีการกระจายอย่างเท่าเทียมกันทั่วทั้งตัวอย่าง การทำแผนที่อุณหภูมิสามารถทำได้ในพื้นที่ปลอดแบคทีเรียเพื่อให้ได้ภาพที่ดีขึ้น ซึ่งเป็นสิ่งที่เราทำในบางครั้ง ภาพ CGM อ้างอิงได้มาโดยไม่ให้ความร้อน (โดยปิดเลเซอร์) และต่อมาก็จับภาพที่ตำแหน่งเดียวกันในภาพโดยเปิดเลเซอร์
การวัดมวลแห้งทำได้โดยใช้กล้อง CGM แบบเดียวกับที่ใช้สำหรับการถ่ายภาพอุณหภูมิ ภาพอ้างอิง CGM ได้มาจากการย้ายตัวอย่างอย่างรวดเร็วใน x และ y ระหว่างการเปิดรับแสง ซึ่งเป็นวิธีการหาค่าเฉลี่ยความไม่เป็นเนื้อเดียวกันใน OT เนื่องจากการมีอยู่ของแบคทีเรีย จากภาพ OT ของแบคทีเรีย ชีวมวลของพวกมันได้มาโดยใช้ชุดภาพเหนือพื้นที่ที่เลือกโดยใช้อัลกอริธึมการแบ่งส่วนแบบโฮมเมดของ Matlab (ดูหัวข้อย่อย "รหัสตัวเลข") ตามขั้นตอนที่อธิบายไว้ในการอ้างอิง 48. กล่าวโดยย่อ เราใช้ความสัมพันธ์ \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\) โดยที่ \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) คือภาพที่มีความลึกเชิงแสง \(m\) คือ น้ำหนักแห้งและ \({{{{\rm{\alpha }}}}}}\) เป็นค่าคงที่ เราเลือก \({{{\rm{\alpha))))))=0.18\) µm3/pg ซึ่งเป็นค่าคงที่ทั่วไปสำหรับเซลล์ที่มีชีวิต
ฝาครอบสลิปที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 25 มม. และหนา 150 µm ที่เคลือบด้วยอนุภาคนาโนทองคำถูกวางลงในห้อง AttofluorTM (เทอร์โมฟิชเชอร์) โดยหงายอนุภาคนาโนทองคำขึ้น จีโอบาซิลลัส สเตียโรเทอร์โมฟิลัสถูกเพาะเลี้ยงล่วงหน้าข้ามคืนในตัวกลาง LB (200 รอบต่อนาที, 60°C) ก่อนการทดลองในแต่ละวัน หยดสารแขวนลอยของ G. stearothermophilus 5 µl ที่มีความหนาแน่นของแสง (OD) 0.3 ถึง 0.5 ถูกวางไว้บนแผ่นปิดที่มีอนุภาคนาโนทองคำ จากนั้นให้วางสลิปฝาครอบทรงกลมที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 18 มม. โดยมีรูที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 5 มม. ตรงกลางหยดลงบนหยด และใช้สารแขวนลอยแบคทีเรีย 5 ไมโครลิตรที่มีความหนาแน่นของแสงเท่ากันซ้ำ ๆ ที่กึ่งกลางของรู หลุมบนแผ่นปิดถูกเตรียมตามขั้นตอนที่อธิบายไว้ในการอ้างอิง 45 (ดูข้อมูลเพิ่มเติมสำหรับข้อมูลเพิ่มเติม) จากนั้นเติมสื่อ LB 1 มล. ลงในแผ่นปิดเพื่อป้องกันไม่ให้ชั้นของเหลวแห้ง แผ่นปิดสุดท้ายจะถูกวางไว้บนฝาปิดที่ปิดของห้อง Attofluor™ เพื่อป้องกันการระเหยของตัวกลางระหว่างการฟักตัว สำหรับการทดลองการงอก เราใช้สปอร์ซึ่งบางครั้งอาจคลุมคลุมด้านบนไว้หลังจากการทดลองทั่วไป ใช้วิธีการที่คล้ายกันเพื่อให้ได้ Sulfolobus shibatae เพาะไธโอบาซิลลัส เซอร์ราตา เบื้องต้นเป็นเวลาสามวัน (200 รอบต่อนาที 75°ซ) ในอาหารปานกลาง 182 (DSMZ)
ตัวอย่างอนุภาคนาโนทองคำถูกเตรียมโดยการพิมพ์หินโคโพลีเมอร์บล็อกไมเซลล์ กระบวนการนี้มีอธิบายรายละเอียดไว้ใน Chap 60. โดยสรุป ไมเซลล์ที่ห่อหุ้มไอออนทองคำถูกสังเคราะห์โดยการผสมโคโพลีเมอร์กับ HAuCl4 ในโทลูอีน จากนั้นนำแผ่นคลุมที่ทำความสะอาดแล้วไปแช่ในสารละลายและบำบัดด้วยการฉายรังสียูวีโดยมีสารรีดิวซ์เพื่อให้ได้เมล็ดทองคำ สุดท้าย เมล็ดทองคำถูกปลูกโดยการสัมผัสแผ่นปิดด้วยสารละลายน้ำของ KAuCl4 และเอทานอลเอมีนเป็นเวลา 16 นาที ซึ่งส่งผลให้มีการจัดเรียงอนุภาคนาโนทองคำที่ไม่ใช่ทรงกลมแบบกึ่งคาบและสม่ำเสมอมากในช่วงอินฟราเรดใกล้
ในการแปลงอินเทอร์เฟอโรแกรมเป็นภาพ OT เราใช้อัลกอริธึมแบบโฮมเมดตามรายละเอียดในลิงก์ V.33 และพร้อมใช้งานเป็นแพ็คเกจ Matlab ในพื้นที่เก็บข้อมูลสาธารณะต่อไปนี้: https://github.com/baffou/CGMprocess แพคเกจสามารถคำนวณความเข้มและภาพ OT ตามอินเทอร์เฟอโรแกรมที่บันทึกไว้ (รวมถึงภาพอ้างอิง) และระยะห่างของอาร์เรย์กล้อง
ในการคำนวณรูปแบบเฟสที่ใช้กับ SLM เพื่อให้ได้โปรไฟล์อุณหภูมิที่กำหนด เราใช้อัลกอริธึมแบบโฮมเมดที่พัฒนาก่อนหน้านี้ ซึ่งมีอยู่ในพื้นที่เก็บข้อมูลสาธารณะต่อไปนี้: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping ข้อมูลเข้าคือช่องอุณหภูมิที่ต้องการ ซึ่งสามารถตั้งค่าแบบดิจิทัลหรือผ่านภาพ bmp ขาวดำ
ในการแบ่งส่วนเซลล์และวัดน้ำหนักแห้ง เราใช้อัลกอริทึม Matlab ของเราที่เผยแพร่ในพื้นที่เก็บข้อมูลสาธารณะต่อไปนี้: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation ในแต่ละภาพ ผู้ใช้จะต้องคลิกที่แบคทีเรียหรือ mCFU ที่สนใจ ปรับความไวของด้ามสแกน และยืนยันการเลือก
สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับการออกแบบการศึกษา โปรดดูบทคัดย่อรายงานการวิจัยธรรมชาติที่เชื่อมโยงกับบทความนี้
ข้อมูลที่สนับสนุนผลการศึกษานี้มีให้จากผู้เขียนที่เกี่ยวข้องตามคำขอที่สมเหตุสมผล
ซอร์สโค้ดที่ใช้ในการศึกษานี้มีรายละเอียดอยู่ในส่วนวิธีการ และเวอร์ชันการแก้ไขจุดบกพร่องสามารถดาวน์โหลดได้จาก https://github.com/baffou/ ในที่เก็บข้อมูลต่อไปนี้: SLM_temperatureShaping, CGMprocess และ CGM_magicWandSegmentation
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK เจาะลึกเรื่องเทอร์โมฟิลส์และการใช้งานในสเปกตรัมกว้าง Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK เจาะลึกเรื่องเทอร์โมฟิลส์และการใช้งานในสเปกตรัมกว้างMehta, R. , Singhal, P. , Singh, H. , Damle, D. และ Sharma, AK ภาพรวมของเทอร์โมฟิลส์และการใช้งานที่กว้างขวาง Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. และ Sharma AK ความเข้าใจอย่างลึกซึ้งเกี่ยวกับเทอร์โมไฟล์และการใช้งานที่หลากหลาย3 เทคโนโลยีชีวภาพ 6, 81 (2016)